人类免疫缺陷病毒I型HIV-RNA核酸定量检测SOP

1、人类免疫缺陷病毒（I型）核酸定量检测系统标准操作程序1 .目的：规范超敏PCR仪器配置系统及人类免疫缺陷病毒（HIV-I RNA）的检测过程，确保 检测结果的准确性和重复性。2 .检测方法和原理2.1 检测方法：TaqMan探针荧光定量PCR法。2.2 检测原理：人类免疫缺陷病毒（I型）核算定量检测试剂盒（PCR-荧光法）采用核酸扩 增技术，定量检测人血浆中HIV-I RNA。该方法包括三个主要步骤：（1）样品制备以分离HIV-I RNA；（2）靶RNA的逆转录形成互补DNA（cDNA）；（3）靶（cDNA）的PCR扩增以及裂解的、 靶特异性的、双标记寡核甘酸探针的检测。3 .标本要求3.1

2、标本类型：血浆（EDTA抗凝）。3.2 标本的采集与处理3.2.1 标本采集量：采集患者静脉血6 mL（EDTA抗凝真空采血管）。3.2.2 标本处理：标本采集后应在2小时内送至实验室，实验室收到标本后在1小时内处理 标本。3.2.2.1 签收：门诊、住院以及CDC标本签收条码，并做好相关登记工作。3.2.2.2 编号：对标本进行唯一编号，内容如下：“年月日6位数字+标本号3位数字”，例 如2018年1月1日收到一个HIV-RNA标本即编号为：“180101401”。3.2.2.3 离心：800-1600g,20min 离心标本。3.2.2.4 标本保存：血浆在室温（25-30）最多存储1天；

3、2-8最多存储6天；-20 一 -80可存储6周。将待检血浆以2管每管1200 uL量存储于2.0mL戴螺旋盖的无菌聚丙烯 管，在管壁编写如3.2.2.2的编号。未检标本放置于专用样本盒中，冻存于-80 冰箱。 已检血浆置-80°C冰箱保存2个月，到期后按科室有关程序作废弃标本处理。4 .仪器和试剂4.2试剂：（配套封闭试剂）4.2.1 试剂盒（包含核酸提取试剂、质控品及阳性定量参考品组分、PCR检测试剂组分）保 存于2-8环境下，有效期22个月。4.2.3 试剂开瓶后，在室温条件下放置时间不应超过72小时；2-8条件下不超过30天。4.2.4 主要组成成份：组份名称规格数量质控品阴

4、性质控品1000P L/ 管1临界阳性质控品1000p L/ 管1强阳性质控品1000p L/ 管1HIV2CS148测试1HIV2CS248测试1HIV2CS348测试1HIV2CS448测试15 .标准操作5.1 COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48 的配置如下:配置实验所需的架子和耗材相应位置COBAS AmpliPrep_COBASTaqMan 48a. K-tubes放在样本架上b. 带有 K-tips 的 K-tip 架c将带有样本或质控的S-tubes放在样本架上d. 带有SPUs的SPU-架e. CS1放在一个试剂架f. CS2, CS3, CS4放在

5、一个试剂架g. 将军的K-carrier放在K-carrier架上样本核酸提取完成后：F-HM-PF-HJ-LAB-EM-P(M-P)K-carrier上的K-tubes手工转移6.2. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用试剂及耗材的保存及注意事项:1) .所有试剂(HIV-I test试剂)2-8保存，即拿即用;2) .试剂启用后，可保存28 days (2-8)；3) .试剂启用后，在Cobas Ampliprep上累计使用时间最多64 hrs；4) . CTM(-)阴性质控、L(+)弱阳性质控、H(+)强阳性质控，使用后的废弃；5) .洗液2-30保存，

6、打开后可使用28 days；6) .耗材(S-tube/样本条码/K-tip/K-tube/SPU)常温保存。6.3. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用样本的保存及注意事项：1) .需要的样本为血浆；2) .血样在225 下运输，24hrs内(HIV RNA)收集出血浆(室温800-1600g离心20分 钟)；3) . HIV RNA检测：血浆可在室温下(25-30)保存最多1天，在28最多保存6天，或 者-20-80下长期保存，至少6周；4) .血浆建议倒取1100-1200 ”L进行保存；5) .血浆冷冻时，最多冻融5次不损失HIV RNA。6.4. C

7、OBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48 HBV DNA 定量检测操作流程：A仪器初始化及维护A1打开COBAS AmpliPrep和COBAS TaqMan开关，等待仪器初始化完成，为stand-by 状态A2登陆电脑及AMPLILINK软件登陆Windows® XP操作系统(User ID 和 password)a)双击桌面上AMPLILINK软件图标b)登陆AMPLILINK 软件(User ID 和 password)A3通过软件Status界面检查洗液量是否足够，如不够需要更换新的洗液A4检查软件维护界面Due按钮下的出的需要进行的维护内容，按照维护手册

8、进行相应内容的维护工作，COBAS AmpliPrep仪器自动进行系统初始化工作B加载试剂将所有试验需要的试剂匣从2-8°C冰箱拿出，立即放在试剂架上并放入COBAS AmpliPrep仪器中，试验开始前在仪器上平衡至少30分钟。不要将试剂匣放在仪 器外进行温度平衡，以免在试剂匣表面形成水凝结，造成条码的损坏。如果在试 剂匣表面有水凝结，不要对条码部位进行擦拭，以免损坏条码造成仪器无法对条 码进行辨识。B1将CS1试剂匣放在一个试剂架上，将试剂匣CS2, CS3 和CS4放于另一个试剂架 上B2将放有CS1的试剂架放入到8845 AmpliPrep仪器中的A位置B3将放有CS2, C

9、S3和CS4的试剂架放入到COBAS AmpliPrep仪器中的B、C、D、E 的任一位置C加载耗材注意：根据检测的样本数计算需要的COBAS AmpliPrep试剂匣数目，样本处理单 元(SPU),样本管。一林6), K-枪头(K-tips)和K-管(K-tubes)的数量。每个 样本或质控分别需要一个SPU, 一个S-tube, 一个K-tip和一个K-tube。C1加载样本处理单元(SPUs)计算需要SPU数量，一个样本或质控需要一个SPU将SPUs 放入到SPU架中，向下压SPU的边缘部分(不要碰至归-tip的部分)使SPU完全坐稳在SPU架的底部确认SPUs正确的放入在SPU架中(若

10、SPUs放置不止确，可能造成仪器运行中停止)将SPU架放入到8845 AmpliPrep仪器的J, K或L位置C3使用COBAS TaqMan 48 分析仪时，将K-carriers K-carrier 架上，放在COBASAmpliPrep 的M, N, O 或 P 位置C4加载K-tip 架于COBAS AmpliPrep 上M, N, O 或 P 位置D创建命令和加载样本D1样本架准备，将样本的条码夹放在样本架上相应有样本管(S-tube)的地方将专用于质控的条码夹放在样本架上与阴性质控(-)C,弱阳性质控L(+)和强 阳性质控相对应的地方注意对相应的质控使用正确的质控条码夹D2 &am

11、p;D3通过AMPLILINK软件创建命令(见下图)在软件orders界面下的Sample rack按钮下创建样本及质控的命令选择相应的检测项目，并进行保存打印创建好的样本及质控工作表D4 &D5在生物安全柜中进行样本准备涡旋混匀样本及质控3-5秒，将1000同样本及质控品转移到相应的样本管S-tube中；避免将颗粒或凝块状物质转移到样本管8-皿匕6中装有样本及质控的样本管放到样本架相应的位置（与创建好的命令工作表中的 位置一致）；确保质控条码上的10t号码与质控的10t号码一致；确保相应的质 控使用正确的质控条码夹；避免样本或质控污染样本管$-皿匕6的上部D6加载带有样本管的样本架于

12、COBAS AmpliPrep仪器的F, G或H位置E开始运行COBAS AmpliPrep仪器E1在AMPLILINK软件上启动运行COBAS AmpliPrep检查Status界面下，确保没有样本、质控或试剂被锁住确保所有的样本和耗材都已加载到COBAS AmpliPrep中，点击Start按钮FCOBAS AmpliPrep仪器运行结束后，手工转移提取好的样本到COBAS TaqMan48 中，应避免将所有提取好的样本及质控直接放置于日光或光源下F1检查AMPLILINK软件中可能显示的标记flags及错误信息F2在COBAS AmpliPrep处理好的样本及质控必须在120分钟内转移到

13、COBAS TaqMan48中开始反应，不要冷冻或在2-8°C储存处理好的样本及质控。F3丢弃COBAS AmpliPrep仪器中的废物G加载处理好的样本及质控G1加载处理好的样本及质控到COBAS TaqMan 48中-通过K-carrier转移工具，手工转移带有 K-carrier 的 K-carrier 架到COBAS TaqMan 48 中01.11.2006 19:36AdmnistratorjrJ 必昌iDiagnosticsSainpleQua 如 CortrdK-CatnerA-RinaSample Rack ID . Batch ID| Date06.11.2006

14、Sample Rack ID08.11.2006CommenJ25.10.2006、annpie iU111他中中Number Test| Cl讨HIVLD 1HIVLO 1HCMCAP96 $N00022001HCMCAP96 5L00022002HIV10 1HCMCAP9G SH00022003ORDEF )004HCMCAP9G $500022004ORDEF XK6HCMCAP96 SS00022005ORDEF )006I HCMCAP96 SS00022006ORDEF KO7I HCMCAP96 $S00022007HCMCAPjHIMUPP48ORDEF J008ORDEF

15、XCSORDEF »10ORDEF )911ORDEF »12QRDEF »13ORDEF D14ORDEF )015ORDEF 3D1SORDEF »17ORDEF »18ORDEF »19ORDEF 麻ORDEF »21ORDEF KI22ORDEF 的ORDEF »2WHIMCAP96| HCMCAP9B $S00022008 HCMCAP96 $500022009HCMCAP96 5S(X»22O1OHCMCAP96 $00022011HCMCAP96HCMCP96HCMCAP96SS000220

16、12 $500022013 $800022014HCMCAP96 $500022015HCMCAP9G$S 0002201 £HCMCAP96 5500022017HCMCAP96 $00022018| HCMCAP96 $500022019| HCMCAP96 $500022020| HCMCAP9G $500022021| HCMCAP9B $500022022HCMCAP96 5500022023HCMCAP9G $500022024H开始运行COBAS TaqManH1打开扩增仪的外部盖子，将K-carrier放入到扩增模块中并关闭盖子，开始运行 COBAS TaqMan 4

17、8ICOBAS TaqMan 48 运行结束I1运行结束，打印结果报告检查结果中的标记flags或错误信息接受结果，数据自动备份(archive)I2将检测完毕的K-tubes从COBAS TaqMan 48的废物盒中拿出，根据实验室规定进 行相应处理或丢弃7 .质量控制7.1 阴性质控品：必须产生“没有检测到目标”的结果。如果有标记标为无效，那么整个批 次都是无效的。7.2 阳性质控品：阳性质控品的检测值应该落在其指定的范围内，如果一个或两个质控品标 记表示无效，那么整个批次无效。8 .结果报告对于有效批次，检查每个样品是否在结果打印中出现标记或注释。结果解释如下：有效 批次可能包括有效和无

18、效样品的结果，这取决于每个样品是否得到标记和/或注释。样品结果解释如下:测定结果解释没有检测到目标HIV-I的CT值超出该检测的界限之上或者未能获得HIV-I的 CT 值。报""HIV-I RNA not detected”。<2.00E+01cp/mL计算所得的cp /mL结果低于该检测试剂检测限。报告为“<20 cp /mL”三 2.00E+01 cp/mL 且 W1.00E+07 cp/mL该区间为检测系统的线性范围>1.00E+07 cp /mL结果超出线性范围。报告”>1.00E+07cp/mL"。如果希望得 到定量结果，必须稀释原始样本，重复该测试。以1： 100与 HIV-I阴性经EDTA处理人类血浆稀释。根据稀释因子换算最 终的结果。9 .性能参数9.1 最低检出限及定量限：试剂最低检出限浓度为20 cp/mL。9.2 精密度：检测高浓度(1.00E+07 cp/mL)，低浓度(2.00E+01 cp/mL)HIV样本，批内及批间的检测浓度对数值的变异系数(CV%)均小于5%。9.3 线性范围：本试剂盒的线性范围为20 cp/mL1.00E+07 cp/mL之间呈线性。以高浓度的HIV定值样本，梯度稀释12个浓度为待检样