第一节克隆载体

1、第一节克隆载体第一节克隆载体质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的的遗传成份遗传成份.Plasmid一词由一词由Joshua Lederberg于于1952年提出。年提出。质粒的命名质粒的命名:例例:pBR322一、质粒载体一、质粒载体p代表质粒代表质粒;“BR”代表两位研究者代表两位研究者Bolivar和和Rogigerus姓氏的字首姓氏的字首,“322”是实验编号是实验编号 .已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。较窄，只能

2、生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝并将质粒分子精确地分配给子代细胞。并将质粒分子精确地分配给子代细胞。1. 质粒的特点：质粒的特点：（一）质粒的基本性质（一）质粒的基本性质其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。 这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具有这些基

3、因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生抗重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及降生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及降解复杂的有机化合物等。解复杂的有机化合物等。质粒通过合成长质粒通过合成长效致死物和短效效致死物和短效解毒剂得以在细解毒剂得以在细菌中生存菌中生存.5、 质粒的类型质粒的类型F质粒的质粒的tra区包含细菌接合所需的基因区包含细菌接合所需的基因质粒的转移与迁移质粒的转移与迁移.转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一

4、个细胞.迁移则指本身不能转移迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下在另一个接合型质粒存在下,从一个细从一个细胞移至另一种细胞胞移至另一种细胞.质粒迁移的条件质粒迁移的条件:bom位点位点(col E1) nic 位点位点.mob基因基因.结合动员基因结合动员基因.编码迁移蛋白编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶实质是一种核酸酶,切割切割nic位点位点.迁移作用迁移作用(mobiligation):由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.因为从理论上存在着发生使跨越生物种间遗传屏障因为从理论上存在着发生使跨越生物种间遗传屏障的潜在危险的潜在危险

5、.而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另一种细胞一种细胞,这种方法叫三亲杂交法这种方法叫三亲杂交法. 一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌 三者共培养过夜.在基因工程中得到大量的应用在基因工程中得到大量的应用.辅助质粒重组质粒供体细胞 受体细胞接合DNA转移三亲杂交法三亲杂交法根据质粒的表现分为根据质粒的表现分为:定义：质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外，定义：质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外，有的质粒还携带一些其他的基因，宿主细胞由于含有有的质粒还携带一些其他的基因，宿主细胞由于含有这样的

6、质粒而呈现出新的性状，这样的质粒称为显性质这样的质粒而呈现出新的性状，这样的质粒称为显性质粒。粒。相反，即使宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表露，相反，即使宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表露，这样的质粒称为隐蔽质粒。这样的质粒称为隐蔽质粒。受检测手段的限制，现定为隐蔽型的质粒未必是真正的受检测手段的限制，现定为隐蔽型的质粒未必是真正的隐蔽质粒。隐蔽质粒。显性质粒和隐蔽质粒显性质粒和隐蔽质粒人工构建的质粒根据其功能及用途分为: (1)多拷贝质粒多拷贝质粒 (2)测序质粒测序质粒 (3)整合质粒整合质粒 (4)穿梭质粒穿梭质粒 (5)表达质粒表达质粒 (6)探针质粒探针质粒环状质粒的复制形式

7、主要分环状质粒的复制形式主要分theta ()及及rolling circle两两种。种。质粒的复制子决定其拷贝数。质粒的复制子决定其拷贝数。复制子是一个遗传单位，包括复制子是一个遗传单位，包括DNA复制起点复制起点,相关的相关的调控元件调控元件,复制终点。复制终点。复制起点是一段特定的复制起点是一段特定的DNA片段，长约几百碱基对，片段，长约几百碱基对，常称为常称为oriV (origin of vegetative replication)；有时；有时R-质粒的复制原质粒的复制原称为称为oriR ,其相关的顺式作用调控元件中含有参与其相关的顺式作用调控元件中含有参与DNA合成起合成起始的由

8、质粒或宿主编码的可扩散因子的结合位点。始的由质粒或宿主编码的可扩散因子的结合位点。定义：质粒定义：质粒DNA中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位。的核酸序列单位。与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列,都是作为复制子的一部分而被复制都是作为复制子的一部分而被复制.起始点是一种顺式作用位点起始点是一种顺式作用位点,只能作用于该位点所只能作用于该位点所在的在的DNA分子分子.质粒的拷贝数定义质粒的拷贝数定义:(1)通常定义通常定义:生长在标准培养条件下生长在标准培养条件下(LB培养基培养基)每个细菌

9、细胞每个细菌细胞中平均所含有的质粒的拷贝数中平均所含有的质粒的拷贝数.(2)特殊定义特殊定义:在营养富有余的培养基中在营养富有余的培养基中,每个细胞当中每条每个细胞当中每条染色体所拥有的平均质粒染色体所拥有的平均质粒DNA分子数分子数.(3)中定义中定义:在在LB液体培养基中生长的每个细胞液体培养基中生长的每个细胞,如果具有如果具有20个及以上的个及以上的质粒质粒DNA分子分子,就叫高拷贝质粒就叫高拷贝质粒,如果低于如果低于20个则叫低拷贝质个则叫低拷贝质粒粒.质粒就其复制方式而言分为两类：质粒就其复制方式而言分为两类：严紧型（严紧型（stringent plasmid)每个寄主细胞中仅有每个

10、寄主细胞中仅有份的拷贝份的拷贝松弛型（松弛型（relaxed plasmid) 每个寄主细胞中仅有份的拷贝每个寄主细胞中仅有份的拷贝一般接合型的质粒是严紧型，具有较高的分子量。一般接合型的质粒是严紧型，具有较高的分子量。而非接合型的质粒是松驰型的，具有较低的分子量。而非接合型的质粒是松驰型的，具有较低的分子量。例外，接合型的质粒例外，接合型的质粒6K分子量较小，为松驰型。分子量较小，为松驰型。质粒中已鉴定的复制子已逾质粒中已鉴定的复制子已逾30个，但分子克隆中常用的几乎个，但分子克隆中常用的几乎都带有一个来源于都带有一个来源于pMB1的复制子，可使每个细菌细胞中维持的复制子，可使每个细菌细胞中

11、维持个拷贝。个拷贝。即同一种质粒在不同的寄主类型中可能属于严紧型的也可能属于松驰型的如ColE1-K30在大肠杆菌中属于松弛型的,在奇异变形杆菌中是严紧型的.氯霉素扩增氯霉素扩增: : pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。另外两种质粒（

12、另外两种质粒（psc101和和p15A）的复制子的复制）的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。 抑制蛋白稀释模型阻遏蛋白在低浓度时处于单体状体，高浓度时处于多体状态。只有多体状态具有活性自体阻遏蛋白质模型阻遏蛋白具有自体阻遏活性。指指在没有选择压力下在没有选择压力下，两种，两种亲缘关系密切亲缘关系密切的不同质粒，的不同质粒，不能够共存于同一个寄主细胞系中的现象。不能够共存于同一个寄主细胞系中的现象。只有当两种只有当两种质粒在同一寄主细胞中都不受限制时质粒在同一

13、寄主细胞中都不受限制时，才能判断，才能判断亲缘关系较近的质粒，彼此之间互不相容，它们属于同亲缘关系较近的质粒，彼此之间互不相容，它们属于同一种不亲和群。一种不亲和群。大肠杆菌质粒中至少已鉴别出种以上的不亲和群。大肠杆菌质粒中至少已鉴别出种以上的不亲和群。质粒不相容性现象与质粒的拷贝数及分离的调控有关质粒不相容性现象与质粒的拷贝数及分离的调控有关.携带相同复制子的不同质粒属于同一不相容组。携带相同复制子的不同质粒属于同一不相容组。带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，大多数质粒都会

14、产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度与质粒的拷贝数成正比。其浓度与质粒的拷贝数成正比。阻遏蛋白通过同其靶序列间的相互作用，使双链中阻遏蛋白通过同其靶序列间的相互作用，使双链中的一条断裂从而导致质粒复制的启动。并建立起一的一条断裂从而导致质粒复制的启动。并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环。当质粒面临高拷贝数和高种调节质粒拷贝数的负反馈环。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。反之，复制浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。反之，复制反应继续进行。反应继续进行。(1)氯化铯密度梯度离心法(2)碱变性法碱变性法一般条件：一般条件：选择适合手头工作目标的质粒载体选择适

15、合手头工作目标的质粒载体选择载体上的限制性内切核酸酶位点选择载体上的限制性内切核酸酶位点用合适的连接反应条件用合适的连接反应条件选用最适合扩增外源目的的质粒的大肠杆菌菌株。选用最适合扩增外源目的的质粒的大肠杆菌菌株。具备筛选转化子的方法和验证目的基因克隆的技术具备筛选转化子的方法和验证目的基因克隆的技术有时需要特殊的步骤以降低转化菌落的背景。有时需要特殊的步骤以降低转化菌落的背景。在每一阶段都需要设置阴性及阳性对照。在每一阶段都需要设置阴性及阳性对照。构建质粒克隆载体的基本策略：构建质粒克隆载体的基本策略：()质粒载体应该能在转化的受体细胞中进行有效的复制。质粒载体应该能在转化的受体细胞中进行

16、有效的复制。作为质粒的克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。作为质粒的克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。所以含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点所以含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点（ori)，最好是松弛型质粒的复制起始位点。，最好是松弛型质粒的复制起始位点。()必须含有允许外源必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，且这样的片段克隆的位点，且这样的克隆位点尽可能多。克隆位点尽可能多。为了便于多种类型末端的为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，质粒克隆片段的克隆，质粒克隆载体中往往组装一个含多种限制性核酸内切酶识别序列载体中往往组装一个含多种限制性核酸内切酶识别序

17、列的多克隆位点的多克隆位点(MCS)连杆。连杆。()必须含有供选择克隆子的标记基因。必须含有供选择克隆子的标记基因。(4)质粒载体本身质粒载体本身DNA分子应尽可能小。分子应尽可能小。()根据需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种根据需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种元件元件，构建，构建成不同用途的质粒克隆载体。成不同用途的质粒克隆载体。如在克隆位点上游组装强的启动子，下游组装相应的终止子，如在克隆位点上游组装强的启动子，下游组装相应的终止子，就成为强表达质粒克隆载体。或者在质粒克隆载体的合适位置就成为强表达质粒克隆载体。或者在质粒克隆载体的合适位置组入受体细胞染色体组入受体细胞染色体DNA的

18、同源序列，成为基因整合平台系统的同源序列，成为基因整合平台系统的供体质粒克隆载体。的供体质粒克隆载体。质粒克隆载体的设计和构建过程应遵循的原则质粒克隆载体的设计和构建过程应遵循的原则：() 选择合适的复制起始位点。选用合适的出发质粒。选择合适的复制起始位点。选用合适的出发质粒。()组装合适的选择标记基因。组装合适的选择标记基因。()增加或减少酶切位点。增加或减少酶切位点。正确获得构建质粒克隆载体的元件。正确获得构建质粒克隆载体的元件。组装一个含有多种单一限制性内切酶识别序列的多克隆位点组装一个含有多种单一限制性内切酶识别序列的多克隆位点(MCS)(4)缩短长度。缩短长度。 在能达到预期目的前提

19、下，构建过程应力求简单。在能达到预期目的前提下，构建过程应力求简单。1、天然质粒、天然质粒指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。常见的可用于基因克隆的天然质粒有：常见的可用于基因克隆的天然质粒有：ColE1, RSF2124和和pSC101pSC101是第一个用于基因克隆的载体。它对于限制酶是第一个用于基因克隆的载体。它对于限制酶EcoR1只有一个识别位点，而且在此克隆外源不影响只有一个识别位点，而且在此克隆外源不影响它的复制功能，也不破坏其唯一的四环素抗性基因。它的复制功能，也不破坏其唯一的四环素抗性基因。其缺点是分子量较大，

20、拷贝数少，且又只有一个抗菌素抗性其缺点是分子量较大，拷贝数少，且又只有一个抗菌素抗性基因，无法用插入失活技术选择重组分子。基因，无法用插入失活技术选择重组分子。ColE1也只有唯一的单切割位点，且可以根据大肠杆菌素也只有唯一的单切割位点，且可以根据大肠杆菌素的免疫性选择转化子，该质粒拷贝数较高，但要用免疫筛选，的免疫性选择转化子，该质粒拷贝数较高，但要用免疫筛选，在化学上相当麻烦。在化学上相当麻烦。RSF2124派生于派生于ColE1,可用氨苄青霉素可用氨苄青霉素的抗性标记进行选择。但仍然不是较好的载体。的抗性标记进行选择。但仍然不是较好的载体。2、理想的质粒载体应具备以下条件：、理想的质粒载

21、体应具备以下条件：）具有复制位点）具有复制位点）具有抗菌素抗性基因。）具有抗菌素抗性基因。）具有若干个限制酶单一识别位点。可以满足基因克隆的需要）具有若干个限制酶单一识别位点。可以满足基因克隆的需要而且在其中插入适当大小的外源片段之后，应不影响质而且在其中插入适当大小的外源片段之后，应不影响质粒的复制功能。粒的复制功能。）具有较少的分子量和较高的拷贝数。）具有较少的分子量和较高的拷贝数。3、选择标记、选择标记质粒载体含有遗传标记，它赋予带有质粒的细菌在选择条质粒载体含有遗传标记，它赋予带有质粒的细菌在选择条件下以较强的生长优势。件下以较强的生长优势。在分子克隆中，这些标记用来：在分子克隆中，这

22、些标记用来：选择带有质粒的细菌克隆。选择带有质粒的细菌克隆。防止负载质粒或质粒编码蛋白质所致的危险因素，保持防止负载质粒或质粒编码蛋白质所致的危险因素，保持转化的细菌。转化的细菌。因为高拷贝的质粒和大量的重组蛋白质可严重妨碍转化因为高拷贝的质粒和大量的重组蛋白质可严重妨碍转化细胞的生长甚至生存，为了防止质粒被从细菌中清除，细胞的生长甚至生存，为了防止质粒被从细菌中清除，在培养基中一直加入合适的抗生素来维持选择压力是重在培养基中一直加入合适的抗生素来维持选择压力是重要的。要的。()高拷贝数的质粒载体高拷贝数的质粒载体()低拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体目的基因产物含量高时对寄主细胞的正常新陈

23、代谢具有扰乱目的基因产物含量高时对寄主细胞的正常新陈代谢具有扰乱作用时用。作用时用。()失控的质粒载体失控的质粒载体是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。根据此原理，发展了失控的质粒载体根据此原理，发展了失控的质粒载体pBEU1和和pBEU2，并成功地用来扩增克隆基因及其编码产物。并成功地用来扩增克隆基因及其编码产物。质粒可累积到细胞总的质粒可累积到细胞总的()插入失活的质粒载体插入失活的质粒载体该类质粒至少含有两个选择记号，在与外源该类质粒至少含有

24、两个选择记号，在与外源DNA的重组过程中，其中一个记号保持完整，用作选择转化子的重组过程中，其中一个记号保持完整，用作选择转化子然后根据另一记号的插入失活效应进一步筛选出转化子，此然后根据另一记号的插入失活效应进一步筛选出转化子，此表明它带有外源表明它带有外源DNA.()正选择的质粒载体正选择的质粒载体应用只有突变体或重组体分子才能正常生长的培养应用只有突变体或重组体分子才能正常生长的培养条件进行选择。可以直接选择记号并给予寄主细胞相应条件进行选择。可以直接选择记号并给予寄主细胞相应的表型。的表型。质粒质粒pKN80带有来自带有来自Mu噬菌体噬菌体DNA的的EcoR1-C片段，片段，它编码一种

25、致死功能的它编码一种致死功能的kil基因。质粒基因。质粒pKN80可以在可以在Mu噬菌体溶源菌株中正常地复制，而对非溶源菌株是致死噬菌体溶源菌株中正常地复制，而对非溶源菌株是致死的。当其的。当其Hpa1或或HINd3位点插入外源位点插入外源DNA后，便会使后，便会使这种致死功能失活。这种致死功能失活。pUR2是另一种正选择质粒载体：是另一种正选择质粒载体：在在X-gal培养基上，生长的转化子菌落，只有含有培养基上，生长的转化子菌落，只有含有pUR2质粒质粒的才能显示出特有的蓝色，而那些在的才能显示出特有的蓝色，而那些在EcoR1、BamH1或或Hind3位点具外源插入的位点具外源插入的pUR2

26、质粒转化子菌落则质粒转化子菌落则呈现白色。呈现白色。()表达载体表达载体按特殊设计构建能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的按特殊设计构建能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体。的克隆载体特称为表达载体。主要组成主要组成包括大肠杆菌的启动子及操纵子位点序列，多克隆位点、包括大肠杆菌的启动子及操纵子位点序列，多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。pBR322质粒质粒由三个不同来源的部分组成：由

27、三个不同来源的部分组成：第一部分来源于第一部分来源于pSF2124质粒易位子质粒易位子Tn3的氨苄青霉素的氨苄青霉素抗性基因（抗性基因（ampr)第二部分来源于第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因质粒的四环素抗性基因(tetr),第三部分是来源于第三部分是来源于ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1DNA复制起点。复制起点。其优点：其优点：分子量小分子量小具有两个抗菌素抗性基因具有两个抗菌素抗性基因插入外源基因后变成插入外源基因后变成ampsTetr 5、常用克隆质粒载体介绍、常用克隆质粒载体介绍tet 四个组成部分：来自于来自于pBR322质粒的复制起点质粒的复制起点氨苄青霉素抗性

28、基因，但它的核苷酸序列发生变化氨苄青霉素抗性基因，但它的核苷酸序列发生变化不再含有原来的核酸内切限制酶位点。不再含有原来的核酸内切限制酶位点。大肠杆菌大肠杆菌半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(lacZ）的启动子及其编码）的启动子及其编码肽链的序列，此特称为肽链的序列，此特称为lacZ基因，基因，位于位于lacZ基因中的靠近基因中的靠近5端的一段端的一段多克隆位点区段多克隆位点区段。EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI

29、 I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rpUC18和和pUC19载体载体其多克隆位点是一段特殊设计的具有许多不同的核酸内切其多克隆位点是一段特殊设计的具有许多不同的核酸内切酶单一识别序列的短序列。酶单一识别序列的短序列。 lacZ基因编码的基因编码的肽链是肽链是半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，它同失去了正常氨基末端的它同失去了正常氨基末端的半乳糖苷酶基因突变体半乳糖苷酶基因突变体互补时，便会产出有功能活性的互补时，便会产出有功能活性的半乳糖苷酶分子。当半乳糖苷酶分子。当pUC质粒转化了染色体基因组存在此种质粒转化了染色体基因组存在此种半乳糖苷酶突变的大

30、肠半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞之后，便会出现具有功能活性的杆菌细胞之后，便会出现具有功能活性的半乳糖酶的积累半乳糖酶的积累,称为称为 互补互补。半乳糖苷酶催化二糖乳糖水解为单糖：葡萄糖和半乳糖。半乳糖苷酶催化二糖乳糖水解为单糖：葡萄糖和半乳糖。该酶的活性可以用该酶的活性可以用X-gal(-溴溴-4-氢氢-吲哚吲哚-3- -半乳糖苷）等半乳糖苷）等显色底物加以检测，显色底物加以检测， 半乳糖苷酶可将半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性转变为不溶性的深蓝色沉淀。的深蓝色沉淀。由于在正常情况下，任何插入到多克隆位点的外源由于在正常情况下，任何插入到多克隆位点的外源片段，都会阻断片段，都会阻断肽链的合

31、成，因此含有重组质粒载体的肽链的合成，因此含有重组质粒载体的克隆是无色的，它可以与含有非重组质粒载体的克隆形成克隆是无色的，它可以与含有非重组质粒载体的克隆形成的蓝色背景明显地区别。的蓝色背景明显地区别。其优点：其优点：具有更小的分子量和更高的拷贝数。具有更小的分子量和更高的拷贝数。适用于组织化学方法检测重组体。一步实现对重组子克隆适用于组织化学方法检测重组体。一步实现对重组子克隆的鉴定。的鉴定。TA载体载体耐热聚合酶可在耐热聚合酶可在PCR产物的产物的3端加上一个非配对的脱氧端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷腺嘌呤核苷(A)，根据此特点研制出线性，根据此特点研制出线性TA质粒载体，其质粒载体，

32、其5端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶(T)，用该载体可进行，用该载体可进行PCR产物的直接克隆。产物的直接克隆。 TA质粒可通过普通质粒进行构建而成。其方法是将一般质粒可通过普通质粒进行构建而成。其方法是将一般质粒线性化，然后通过一些方法形成平末端，再在末端加质粒线性化，然后通过一些方法形成平末端，再在末端加上上T就可得到。就可得到。 常见的有常见的有TaKaRa公司的公司的pMD18-T穿梭质粒载体穿梭质粒载体具有两种具有两种不同复制起点不同复制起点和和选择标记选择标记，可在，可在两种不同的寄主两种不同的寄主细胞细胞中存活和复制的质粒载体。可以携带外源基因在不

33、同中存活和复制的质粒载体。可以携带外源基因在不同物种细胞之间，特别是真核和原核细胞之间往返穿梭，所物种细胞之间，特别是真核和原核细胞之间往返穿梭，所以十分有用。以十分有用。目前已构建了可在大肠杆菌与枯草杆菌、酿酒酵母和动物目前已构建了可在大肠杆菌与枯草杆菌、酿酒酵母和动物体中进行穿梭的载体。植物与大肠杆菌的穿梭载体还未发体中进行穿梭的载体。植物与大肠杆菌的穿梭载体还未发现。现。二噬菌体载体二噬菌体载体病毒核酸外壳蛋白外壳蛋白包装包装病毒颗粒病毒颗粒病毒颗粒病毒颗粒实现病毒的实现病毒的增殖增殖利用此性质，可以构建各类病毒载体。利用此性质，可以构建各类病毒载体。感染感染利用其利用其体系体系宿主细胞

34、宿主细胞DNA(RNA)复制复制和蛋白的和蛋白的合成合成病毒病毒细菌病毒细菌病毒植物病毒植物病毒动物病毒动物病毒称噬菌体，有双链的，单链的称噬菌体，有双链的，单链的如花椰菜花叶病毒，如花椰菜花叶病毒，烟草花叶病毒等烟草花叶病毒等如如SV40,劳斯肉瘤病毒（反转录病毒）劳斯肉瘤病毒（反转录病毒）腺病毒哺乳动物和禽类中都有分布腺病毒哺乳动物和禽类中都有分布痘苗病毒在哺乳动物细胞胞浆中增殖痘苗病毒在哺乳动物细胞胞浆中增殖杆状病毒（感染昆虫等无脊椎动物）杆状病毒（感染昆虫等无脊椎动物）在结构上没有细胞结构，比原核和真核简单但比质粒复杂，因为它还编码蛋白质外壳。噬菌体概念噬菌体概念1 保护自已的核酸分子

35、免遭环境化学物质的破坏保护自已的核酸分子免遭环境化学物质的破坏2 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞3 将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，大量将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，大量产生子代噬菌体。产生子代噬菌体。4 4 使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒无尾部的二十面体型具尾部的二十面体型（多数）线状体型。双链环性DNA单链环形DNA单链线性DNA单链RNA噬菌体的感染性噬菌体的感染性噬菌体的感染效率高到令人生畏的程度。噬菌体的感染效率高到令人生畏的程度。在琼脂糖在琼脂糖平板上形平板上形成噬菌斑。成噬菌斑。

36、吸附、注入，整合、复吸附、注入，整合、复制制形成清晰的噬菌斑形成清晰的噬菌斑噬菌体的噬菌体的生命周期生命周期溶菌周期溶菌周期溶源周期溶源周期吸附、注入，转变、合吸附、注入，转变、合成成 组装组装 释放释放溶源化溶源化lysogenization：用温和的噬菌体感染细菌培养物：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程使之形成溶源性细菌的过程。整合：如果噬菌体的整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体是被包容在寄主细菌染色体DNA之中，便叫做已整合的噬菌体之中，便叫做已整合的噬菌体DNA.这种噬菌体这种噬菌体DNA组入细组入细菌染色体菌染色体DNA的过程，称噬菌体的过程，称噬菌

37、体DNA的整合或插入。以游的整合或插入。以游离离DNA分子形式存在的噬菌体分子形式存在的噬菌体DNA，叫做非整合的噬菌体，叫做非整合的噬菌体DNA.一些常见概念 一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用“( )”或或“/”等加以区别表示。等加以区别表示。这种类型的基本特征是不存在噬菌体这种类型的基本特征是不存在噬菌体DNA分子的整合分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒粒DNA分子。分子。溶源性细菌有两个重要特点溶源性细菌有两个重要特点第一，不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再第一，

38、不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染感染。溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染免疫性。的特性，叫做超感染免疫性。第二，经过许多世代之后，溶源性的细菌便能够开始进第二，经过许多世代之后，溶源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。这个过程叫做溶源性细菌的诱发。入溶菌周期。这个过程叫做溶源性细菌的诱发。在诱发过程中，噬菌体基因组以单一在诱发过程中，噬菌体基因组以单一DNA片段的形式从片段的形式从寄主染色体寄主染色体DNA上删除下来。上删除下来。DNA的结构的结构2 选用选用ABCDEFABD+E+F *4 构建构建BHB2688

39、是是E基因缺失的基因缺失的噬菌体头部外壳蛋白质容纳噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型上限不得超过其正常野生型DNA总量的总量的5左右，而低限左右，而低限又不得少于正常野生型又不得少于正常野生型DNA总量的总量的75。 按野生型按野生型DNA分子长度为分子长度为 48kb计算，即计算，即噬菌体只容许噬菌体只容许包装包装34.6kb的的DNA片段。片段。 编码必要基因的编码必要基因的DNA区段占区段占28kb，因此，因此载体克隆外源载体克隆外源DNA的理论极限值应是最大的理论极限值应是最大23kb,最小最小6.6Kb。外源外源DNA克

40、隆到插入型的克隆到插入型的 载体分子上，会使噬菌体的某些生载体分子上，会使噬菌体的某些生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。在其免疫区带有一两种核酸内切酶的单切割位点。外源片段在其免疫区带有一两种核酸内切酶的单切割位点。外源片段插入到该位点之后插入到该位点之后,合成活性阻遏物的功能遭受破坏，不能进合成活性阻遏物的功能遭受破坏，不能进入溶源周期。入溶源周期。凡带有外源凡带有外源DNA插入的插入的 重组体都只能形成清晰的噬菌斑，重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。

41、这种形态上的差异，为分离重组体分子提供了方便的标志。这种形态上的差异，为分离重组体分子提供了方便的标志。根据插入效应的特异性，又可分为以下两种根据插入效应的特异性，又可分为以下两种可以通过噬菌斑的颜色判断有无外源基因的插入可以通过噬菌斑的颜色判断有无外源基因的插入替换型载体又叫取代型载体，在其中央部替换型载体又叫取代型载体，在其中央部分有一个可以被外源插入的分有一个可以被外源插入的DNA分子所分子所取代的取代的DNA片段的克隆载体。片段的克隆载体。在构建此类载体时，安排在中央可取代片在构建此类载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此当

42、外源此当外源DNA插入时，一对克隆位点之插入时，一对克隆位点之间的间的DNA片段便会被置换掉，从而有效片段便会被置换掉，从而有效地提高克隆外源地提高克隆外源DNA的能力。的能力。（二）（二） M13噬菌体噬菌体为了测序的需要，可应用丝状噬菌体产生单链为了测序的需要，可应用丝状噬菌体产生单链DNA。M13噬菌体载体以野生型M13噬菌体为原始载体，进行以下改造：在IS区加入选择性标记基因，组装合适的多克隆位点噬菌体展示载体噬菌体展示载体 在丝状噬菌体颗粒一端的表面，存在在丝状噬菌体颗粒一端的表面，存在3-5个拷贝的基因个拷贝的基因 编码的蛋白质。这类蛋白质对于噬菌体颗粒的正确组装，编码的蛋白质。这

43、类蛋白质对于噬菌体颗粒的正确组装，及其对大肠杆菌雄性细胞及其对大肠杆菌雄性细胞F性须的吸附过程，均具有重要性须的吸附过程，均具有重要功能。功能。 当外源当外源DNA插入在噬菌体的基因插入在噬菌体的基因 编码序列中时，编码序列中时，在两者读码结构保持一致的情况下，就会产生出由克隆基在两者读码结构保持一致的情况下，就会产生出由克隆基因与基因因与基因 联合编码的融合蛋白质。因此可利用此特性构联合编码的融合蛋白质。因此可利用此特性构建噬菌体展示载体。建噬菌体展示载体。 将随机的多肽将随机的多肽DNA弹夹插入在基因弹夹插入在基因 的编码序列中，的编码序列中，使在噬菌体颗粒的表面展现出各种不同的蛋白质或多

44、肽使在噬菌体颗粒的表面展现出各种不同的蛋白质或多肽此即是通常所说的随机多肽文库。然后通过亲和层析处此即是通常所说的随机多肽文库。然后通过亲和层析处理，将所要分离的某种特定的目标噬菌体，例如展示具理，将所要分离的某种特定的目标噬菌体，例如展示具有抗体结合特性的多肽的噬菌体颗粒分离出来。经过如有抗体结合特性的多肽的噬菌体颗粒分离出来。经过如此多次的层析和增殖后，所得的噬菌体制剂便可用于进此多次的层析和增殖后，所得的噬菌体制剂便可用于进一步富集具有期望结合特性的目标噬菌体。一步富集具有期望结合特性的目标噬菌体。三、噬菌体三、噬菌体-质粒杂合载体质粒杂合载体1978年，年，Collins 及及B.Ho

45、hn等人发展出的柯斯质粒载体等人发展出的柯斯质粒载体(cosmid vectors)可以满足这一要求。可以满足这一要求。Cosmid：是英文：是英文cos site-carrying plasmid缩写而成的。缩写而成的。其原意是指带有粘性末端位点（其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。）的质粒。即一类由人工构建的含有即一类由人工构建的含有Cos位点位点：柯斯质粒具有质粒的复制子，因此在寄主细胞内能柯斯质粒具有质粒的复制子，因此在寄主细胞内能够像质粒够像质粒DNA一样复制，并且在氯霉素作用下，同样也一样复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。且具有抗菌素标记，可供作重组会获得

46、进一步的扩增。且具有抗菌素标记，可供作重组体分子表型选择，有的还带有插入位点。体分子表型选择，有的还带有插入位点。由于其载体分子仅具有一个复制起点，一两个选择标记和由于其载体分子仅具有一个复制起点，一两个选择标记和Cos位点等三个组成部分，其分子量较少，一般只有位点等三个组成部分，其分子量较少，一般只有5-7kb左右。其克隆极限可达左右。其克隆极限可达45kb，比噬菌体和质粒载体的最大，比噬菌体和质粒载体的最大克隆能力都要大很多。由于包装限制的缘故，柯斯质粒载克隆能力都要大很多。由于包装限制的缘故，柯斯质粒载体的克隆能力还有一个最低极限制值。如果载体分子为体的克隆能力还有一个最低极限制值。如果

47、载体分子为5Kb,那么插入片段最少得有那么插入片段最少得有30kb长。才能够装形成具有感染长。才能够装形成具有感染能力的噬菌体颗粒。能力的噬菌体颗粒。因此柯斯质粒载体用于克隆大片段的因此柯斯质粒载体用于克隆大片段的DNA分子。分子。()一旦柯斯载体与一种带有同源序列的质粒载体共存于同一旦柯斯载体与一种带有同源序列的质粒载体共存于同一个寄主细胞，它们之间便会形成共合体。如果让柯斯一个寄主细胞，它们之间便会形成共合体。如果让柯斯质粒与质粒各自具有一个互不相同的抗药性标记及相容质粒与质粒各自具有一个互不相同的抗药性标记及相容性的复制起点，那么当它们转化到同一寄主细胞之后，便性的复制起点，那么当它们转

48、化到同一寄主细胞之后，便可容易地筛选出含有两个不同选择标记的共合体分子。可容易地筛选出含有两个不同选择标记的共合体分子。 由于包装限制问题，只有当柯斯质粒含有适当数由于包装限制问题，只有当柯斯质粒含有适当数量的外源量的外源DNA分子插入的情况下，才会发生包装作用。分子插入的情况下，才会发生包装作用。柯斯克隆的一般过程：柯斯克隆的一般过程： 外源基因组的消化外源基因组的消化柯斯质粒的线性化及与外源柯斯质粒的线性化及与外源DNA分子进行体外连接反应。分子进行体外连接反应。包装包装3 3、柯斯克隆的技术的优点、柯斯克隆的技术的优点主要有两个方面：主要有两个方面：第一由于柯斯载体兼具了质粒和第一由于柯

49、斯载体兼具了质粒和 噬菌体两方面的特性噬菌体两方面的特性提高了克隆外源提高了克隆外源DNADNA片段的能力片段的能力，可达，可达45kb45kb左右，因此左右，因此对于构建真核生物基因文库是种特别有用的克隆载体。对于构建真核生物基因文库是种特别有用的克隆载体。第二应用柯斯质粒作克隆载体，所形成的非重组体的克隆第二应用柯斯质粒作克隆载体，所形成的非重组体的克隆本底比较低本底比较低，即便不使用插入失活或碱性磷酸酶对线性化，即便不使用插入失活或碱性磷酸酶对线性化的柯斯质粒的柯斯质粒DNADNA作预处理，其结果亦是如此。从而提高了作预处理，其结果亦是如此。从而提高了筛选具外源筛选具外源DNADNA的重

50、组体质粒的几率的重组体质粒的几率。（二）噬菌粒载体（二）噬菌粒载体问题的提出问题的提出M13可方便地用来制备克隆基因的单链可方便地用来制备克隆基因的单链DNA。所以在基因。所以在基因工程研究中很有用。工程研究中很有用。但插入的片段遗传稳定性下降，且随片段分子量的增加，但插入的片段遗传稳定性下降，且随片段分子量的增加，其稳定性降低的程度也越严重。其稳定性降低的程度也越严重。 所以其克隆外源所以其克隆外源DNA的实际能力十分有限，一般情况下，的实际能力十分有限，一般情况下，最大克隆能力只有最大克隆能力只有1500bp.使其中真核基因克隆中的实用价值大使其中真核基因克隆中的实用价值大大折扣。大折扣。

51、 为了解决此问题，已经发展出一类由质粒载体和单链噬菌体为了解决此问题，已经发展出一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒(phasmid)。噬菌粒载体的特点噬菌粒载体的特点噬菌粒载体的分子量一般都比噬菌粒载体的分子量一般都比M13载体的小，约为载体的小，约为3000bp，易于体外操作，可得到长达，易于体外操作，可得到长达10kb的外源的外源DNA的单链序列。的单链序列。由于具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点由于具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点因此在大肠杆菌寄主细胞中，可以按正常的双链质粒因此在大肠杆菌寄主细胞中

52、，可以按正常的双链质粒分子形式复制，形成的双链分子形式复制，形成的双链DNA既稳定又高产。具有既稳定又高产。具有常规的质粒特性。常规的质粒特性。当存在着辅助噬菌体的情况下，在噬菌体基因当存在着辅助噬菌体的情况下，在噬菌体基因 蛋白蛋白质的影响下，噬菌粒的复制方式发生改变，又可如同质的影响下，噬菌粒的复制方式发生改变，又可如同M13载体一样按滚环模型复制产生单链的载体一样按滚环模型复制产生单链的DNA，并在，并在包装噬菌体颗粒之后被挤压出寄主细胞。包装噬菌体颗粒之后被挤压出寄主细胞。应用噬菌粒可直接进行克隆应用噬菌粒可直接进行克隆DNA片段的序列测定，免片段的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的

53、亚克隆步聚。去了从质粒载体到噬菌体的亚克隆步聚。 与与M13相比，噬菌粒载体具有分子量小、克隆能力大相比，噬菌粒载体具有分子量小、克隆能力大能稳定遗传以及可用来制备单链或双链能稳定遗传以及可用来制备单链或双链DNA等诸多等诸多优点。优点。 是一对分别由是一对分别由pUC18, pUC19质粒与野生型质粒与野生型M13噬菌体的基因间隔区重组而成的噬菌粒载体。除了噬菌体的基因间隔区重组而成的噬菌粒载体。除了多克隆位点区的序列取向彼此相反而外，两者的分多克隆位点区的序列取向彼此相反而外，两者的分子结构完全一样。如果有某一种特定的外源基因被子结构完全一样。如果有某一种特定的外源基因被插入在这一对噬菌体

54、多克隆位点区的同一种限制位插入在这一对噬菌体多克隆位点区的同一种限制位点上，那么所形成的重组载体中的一个将转录克隆点上，那么所形成的重组载体中的一个将转录克隆基因的正链基因的正链DNA,而另一重组载体则转录克隆基因的而另一重组载体则转录克隆基因的负链。负链。染色体结构染色体结构真核生物的染色体在形态上具有共同的特征：真核生物的染色体在形态上具有共同的特征：线状、中间有着丝粒把染色体分成两臂，两线状、中间有着丝粒把染色体分成两臂，两臂末端各有一个端粒，在染色体上有数目不等臂末端各有一个端粒，在染色体上有数目不等的复制起始点。的复制起始点。是真核生物染色体是真核生物染色体的三个最基本的组成元件。的

55、三个最基本的组成元件。着丝粒着丝粒DNA称称CEN DNA复制起始点复制起始点DNA为自主复制序列为自主复制序列(ARS)人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体 实际上是一种穿梭载体。实际上是一种穿梭载体。含有质粒克隆载体所必备的第一受体源质粒复制起始位含有质粒克隆载体所必备的第一受体源质粒复制起始位点，还含有第二受体染色体点，还含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。始位点的序列，以及合适的选择标记基因。人工染色体载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式人工染色体载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制。这种克隆载体在体外

56、与目的进行高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体体DNA复制的形式进行复制和传递。复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记，筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记，而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型，与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特型，与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达点是能容纳长达1000甚至甚至3000kb的外源的外源DNA片段。片段。(一）酵母人工染色体（一）酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）1983年，年，Murray and zostakYAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：需要，必须含有以下元件：端粒重复序列端粒重复序列着丝粒