动物细胞工程第二节(志强上课用)

1、知识回顾：l动物细胞工程技术包括有哪些技术；其基本工程技术是什么；l动物细胞培养指的是什么？依据原理；l动物细胞培养需要哪些条件；动物细胞培养和植物组织培养的培养基主要区别有哪些？l动物体细胞核移植指的是什么？依据的原理；l简述动物体细胞核移植过程；核移植流程核移植流程:1、供体细胞的采集与培养、供体细胞的采集与培养6、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。数分裂进程。5、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞、将供体细胞注入去核卵母细胞3、显微

2、操作去除卵母细胞中的核、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用1 1、定义：、定义：指用自然或人工方指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合一、动物细胞融合细胞杂交：细胞杂交：不同基因型的细不同基因型的细胞之间的融合就是胞之间的融合就

3、是细胞杂交细胞杂交。杂交细胞：杂交细胞：融合后形成的具融合后形成的具有原来有原来两个或多个细胞遗传两个或多个细胞遗传信息信息的的单核细胞单核细胞成为杂交细成为杂交细胞胞。2、诱导融合的方法：诱导融合的方法： 生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒诱导融诱导融合合.(.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。合所特有的。 这是由于病毒的磷脂外这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。进细胞融合的功能。) ) 化学法：化学法：聚乙二醇聚乙二醇PEG

4、PEG诱导融合诱导融合. . 物理法：物理法：电激电激融合融合病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。3 3、动物细胞融合技术的意义、应、动物细胞融合技术的意义、应用用意义：细胞融合技术突破了有性杂交的局意义：细胞融合技术突破了有性杂交的

5、局 限，使远缘杂交成为可能。限，使远缘杂交成为可能。应用：利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。应用：利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。 人们获得抗体的传统方法是人们获得抗体的传统方法是? ?将抗原注入动物体将抗原注入动物体, ,然后从动物血清中提取抗体然后从动物血清中提取抗体 这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么? ?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。能产生严重的过敏反应。 运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？ 能否用单个能否用单个B B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来淋巴细

6、胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？产生单一类型的抗体呢？B B淋巴细胞在体外不能无限增殖。淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备思思考考单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备极富创造性的方案极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖能和具有无限增殖能力的力的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种的特异性抗体。

7、这种单一类型的只针对某一特定抗原单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 米尔斯坦米尔斯坦( (阿根廷阿根廷) )和科勒和科勒( (德国德国) )因此在因此在19841984年获诺年获诺贝尔奖。贝尔奖。提取提取用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基1.动物特异性免疫动物特异性免疫2.分离分离B淋巴细胞（淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意）。注意B淋巴细淋巴细胞是一个系列。（胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）3.细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:（BB;BG;GG）4.第一次筛选：在第一次筛选：

8、在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（只有（只有BG杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：杂交瘤细胞也是一个系列：如如B1G,B2G-BnG。而。而BB,GG在此培养基上不能存活。）在此培养基上不能存活。）5.第二次筛选：在第二次筛选：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列每孔每孔只放一个杂交瘤细胞。只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进每个杂交瘤细胞，并进行行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。瘤细胞。6.选择

9、所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射到或注射到小鼠腹腔小鼠腹腔内增殖内增殖。7.提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：、单抗的制备过程要点：4 4）、如何进行第）、如何进行第2 2次筛选？次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2 2次筛选得次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：问题强化：1 1）、本过程利用了哪些原理？）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞

10、融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体本领，因而可以获得大量单克隆抗体 1、作为诊断试剂作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等体内肿瘤的定位等, ,与常规抗体相比与常规抗体相比, ,具有具有准确、高

11、效、准确、高效、简易、快速简易、快速特点特点. 2、用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物： 主要用于癌症治疗。主要用于癌症治疗。 生物导弹：生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体抗癌细胞的单克隆抗体+ +放射性同位素放射性同位素+ +化学化学药物或细胞毒素药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）胞位置，原位杀死癌细胞。） 特异性强，灵敏度高，可大量制备。特异性强，灵敏度高，可大量制备。3 3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用B B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞足够数量的细胞群群注射到注

12、射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案风杆菌单克隆抗体的实验方案2 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4 4、图中、图中B B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,_,又能又能_。1 1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3 3、A A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5 5、C C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代5050练习练习3 3：练习练习4 4：单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中