第3章PCR与DNA测序

1、第三章第三章 核酸的体外扩增与测序核酸的体外扩增与测序CQMU一、一、PCR技术简史技术简史PCR的实现的实现 1985年年美国美国PE-Cetus公司公司人类遗传研究室的人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合的体外合成提供一种合适的条件：摸板适的条件：摸板DNA 、寡核苷酸引物、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓聚合酶、合适的缓冲体系，以及冲体系，以及DNA变性、复性及延伸的温度与时间。变性、复性及延伸的温度与时间。

2、第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）PCR的的改进与完善改进与完善Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合酶是聚合酶是大肠大肠杆菌杆菌 DNA 聚合酶聚合酶 I 的的Klenow片段片段，其缺点是：，其缺点是：Klenow酶不耐高温，酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都需会变性失活，每次循环都需 要重新添加。要重新添加。引物链延伸反应在引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物下进行，容易发生模板和引物 之间的碱基错配，其之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的产物特异性较差，合成的 DNA片段不均一。片段不均一

3、。这种以这种以Klenow酶催化的酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在酶不耐热，在DNA模板进行热模板进行热变性时，会导致聚合酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩变性时，会导致聚合酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，年初，Keohanog改用改用T4 DNA聚合酶聚合酶进行进行PCR，其扩增，其

4、扩增的的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年年Saiki 等从一株水生嗜热杆菌等从一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中中提取到一种耐热提取到一种耐热DNA聚合酶。聚合酶。 此酶具有以下特点：此酶具有以下特点：耐高温，在耐高温，在70下反应下反应2h后其残留活性大于原来的后其残留活性大于原来的90%， 在在93下反应下反应2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的60%，在，在95下反应下反应 2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原

5、来的40%。在热变性时不会被钝化在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名片段区别，将此酶命名为为Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使。此酶的发现使PCR广泛的被应用。广泛的被应用。 二、二、PCRPCR技术的基本原理

6、技术的基本原理 类似于类似于DNADNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。两端互补的寡核苷酸引物。PCRPCR由变性由变性-退火退火-延伸三个延伸三个基本反应步骤构成：基本反应步骤构成：1 1、基本原理、基本原理退火退火（annealingannealing）（复性）：模板）（复性）：模板DNADNA经加热变性成单经加热变性成单链后，将温度降至引物的链后，将温度降至引物的TmTm值左右或以下（值左右或以下（5555左右），左右），引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合，形成杂交链。单链的互补序列配对结合，形成杂交

7、链。变性变性（denaturedenature）：模板）：模板DNADNA经加热至经加热至9595左右一定时间左右一定时间后，使模板后，使模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，使之解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。延伸延伸(extension)(extension)：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，

8、合成一条新的与模板与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA DNA 链互补的半保链互补的半保留复制链。留复制链。 以上三步为一个循环，约需以上三步为一个循环，约需2 24 4分钟，每一循环的产物作分钟，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环为下一个循环的模板，如此循环3030次，大约次，大约2 23 3小时后，新小时后，新生生DNADNA片段理论上可达到片段理论上可达到2 2n n-1-1个分子拷贝。个分子拷贝。PCR反应的基本原理示意图反应的基本原理示意图3 3 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAA

9、CGGCTAGGCATTTGATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5 55 5 ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC. CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3 ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC. CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3 变性（变性（950C，30s）3 3TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT55 5 ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC. A

10、TAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3退火（退火（450C550C，30s 1min）5ataagcccgaaaggt3 3 aacggctaggcattt5 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTTATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAATAAGCCCGAAAGGTT

11、CGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA5 ataagcccgaaaggttcg tccaacggctaggcattt 5 延伸（延伸（720C，1 几分钟）几分钟）TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT TataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA AATAAGC

12、CCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcatttTATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt循环循环 25 3055335533目的目的DNA扩增扩增106-7倍倍5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5

13、5 目的片段？目的片段？Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。1、标准的、标准的PCR反应体系反应体系 （50100ul） 三、三、PCR反应体系与反应条件反应体系与反应条件10缓冲液缓冲液 1/10体积体积4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L引物引物 各各1u mol/L模板模板DNA 1 02 1 05 拷贝拷贝Taq DNA聚合酶聚合酶 1 5uMg2+ 1.5mmol/L双蒸水双蒸水 至至50100ul2、PCR引物设计引物设计 PCR

14、反应中有两条引物，即反应中有两条引物，即55端引物和端引物和33引物引物。设计。设计引物时以一条引物时以一条DNADNA单链为基准（常以信息链为基准），单链为基准（常以信息链为基准），55端端引物与位于待扩增片段引物与位于待扩增片段55端上游的一小段端上游的一小段DNADNA序列相同；序列相同；33端引物与位于待扩增片段端引物与位于待扩增片段33端的一小段端的一小段DNADNA序列互补。序列互补。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTTATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTAT

15、AAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA5 ataagcccgaaaggttcg tccaacggctaggcattt 5 55335533基准基准引物长度引物长度：15-30bp，常用为，常用为20bp左右。左右。引物碱基引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜，为宜，G+C太少扩增效果不太少扩增效果不佳，佳，G+C 过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排

16、列。个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物内部引物内部不应出现互补序列。不应出现互补序列。两个两个引物之间引物之间不应存在互补序列，尤其是避免不应存在互补序列，尤其是避免3 端的端的互补重叠。互补重叠。引物设计的基本原则：引物设计的基本原则：引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引，引物物3末端连续末端连续8 8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。否则易导致非特异性扩增。引物引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对

17、，最佳选择是格要求配对，最佳选择是G和和C。引物的引物的5 端可以修饰端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。包括起始密码子、终止密码子等。几种常见引物设计缺陷几种常见引物设计缺陷 引物设计软件引物设计软件oPrimer Premier5.0 （自动搜索）（自动搜索）*oOligo6 （引物评价）（引物评价）oVector NTI SuitoDNAsisoOmigaoDNAstaroPrimer3 （在线服务）（在线服务）3、模板的

18、制备、模板的制备PCR的模板可以是的模板可以是DNA，也可以是，也可以是RNA。模板的取材主要依据模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶和蛋白酶K处理。难以破碎的细处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加菌，可

19、用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制处理。所得到的粗制DNA，经酚、，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。反应模板。4、PCR反应条件的控制反应条件的控制PCR反应的缓冲液反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子提供合适的酸碱度与某些离子镁离子浓度镁离子浓度 总量应比总量应比dNTPs的浓度高，常用的浓度高，常用1.5mmol/L底物浓度底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，以等摩尔浓度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶聚合酶 2.5U（100ul）引物引物 浓度一般为浓度一般为0.1 0.5umol/L反应温度和循环次数反应温度和

20、循环次数变性温度和时间变性温度和时间 95，30s退火温度和时间退火温度和时间 低于引物低于引物Tm值值5 左右，一般在左右，一般在4555延伸温度和时间延伸温度和时间 72，1min/kb（10kb内）内）Tm值值=4(G+C) 2(A+T) 循环次数循环次数 一般为一般为25 25 3030次。循环数决定次。循环数决定PCRPCR扩增的产量。模板初扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为并不是可以无限增加的。一般循环数为3030个左右，循环数超个左右，循环数超过过3030个以

21、后，个以后，DNADNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期平台期”。四、四、PCR反应特点反应特点 PCR反应的特异性决定因素为：反应的特异性决定因素为：引物与模板引物与模板DNA特异正确的结合；特异正确的结合；（关键）（关键）碱基配对原则；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。靶基因的特异性与保守性。 1、特异性强、特异性强2、灵敏度高、灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数级增加的，能将皮克产物的生成量是以指数级增加的

22、，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。水平。能从能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检出率为出率为3个细菌。个细菌。 3、简便、快速、简便、快速 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。扩增检测。 4、对标本的纯度要求低、对标本的

23、纯度要求低五、五、PCR扩增产物的分析扩增产物的分析 1、凝胶电泳分析凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳: 通常应用通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。 2、酶切分析、酶切分析 3、分子杂交、分子杂交 4、核酸序列分析、核酸序列分析 酶切酶切结果结果七、七、PCR技术应用进展技术应用进展 1、筑巢、筑巢PCR先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引先用一对外侧引

24、物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因。筑巢物以大片段为模板扩增获取目的基因。筑巢PCR可以提高可以提高PCR的效率和特异性。的效率和特异性。2、共享引物、共享引物PCR利用利用3条引物扩增两种不同的条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两序列，其中一条引物与两种待扩序列都互补，它与另两条引物分别组成两对种待扩序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引引物。常用于确定同属细菌的不同种。物。常用于确定同属细菌的不同种。3、多重、多重PCR在一次反应中加入多对引物，由于每一对引物与模板在一次反应中加入多对引物，由于每一对引物与模板DNA的不同片段相结合，因

25、而扩增片段长短不同。由此可检测的不同片段相结合，因而扩增片段长短不同。由此可检测是否存在某些基因片段的缺失或突变。是否存在某些基因片段的缺失或突变。4、不对称、不对称PCR （获取单链（获取单链DNA）两条引物使用不同的浓度两条引物使用不同的浓度,在低浓度引物逐渐耗尽时，高浓在低浓度引物逐渐耗尽时，高浓度引物介导的度引物介导的PCR反应就会产生大量单链反应就会产生大量单链DNA。5、锚定、锚定PCR （用于欲扩增片段旁侧序列不清楚时获取目的片段）（用于欲扩增片段旁侧序列不清楚时获取目的片段）mRNA或总或总RNA33555533合成第一链合成第一链cDNA逆转录酶逆转录酶5533GG GG末端

26、转移酶末端转移酶5533GG GGCC CC扩增扩增6、反向、反向PCR（扩增已知（扩增已知DNA序列两侧的未知序列）序列两侧的未知序列）已知序列已知序列酶切酶切环化环化PCR7、彩色、彩色PCR用不同的荧光物质标记引物用不同的荧光物质标记引物5端，扩增后产物可发出不同颜端，扩增后产物可发出不同颜色的荧光。色的荧光。8、原位、原位PCR将组织固定将组织固定, 处理细胞内的处理细胞内的DNA或或RNA后，进行后，进行PCR扩增。扩增。 9、重组、重组PCR（研究基因结构与功能的关系）（研究基因结构与功能的关系）用合成带突变的引物，复制完整的突变基因。用合成带突变的引物，复制完整的突变基因。11、

27、定量定量PCR（对（对mRNA进行定量测定）进行定量测定）用用PCR反应结束时的反应结束时的DNA含量来推测模板含量来推测模板DNA的量，通常用的量，通常用正常稳定表达的基因作参照。正常稳定表达的基因作参照。 10、差异显示、差异显示PCR （筛选和克隆差异表达基因）（筛选和克隆差异表达基因）将所要比较的两种将所要比较的两种mRNA样品逆转录生成样品逆转录生成cDNA第一链，再用第一链，再用3锚定引物和锚定引物和5随机引物进行随机引物进行PCR反应，通过电泳比较反应，通过电泳比较PCR产产物的差异片段，再经过片段回收、再扩增和物的差异片段，再经过片段回收、再扩增和mRNA杂交分析、杂交分析、克

28、隆及序列分析，最终确定差异表达的基因。克隆及序列分析，最终确定差异表达的基因。一、一、逆转录逆转录所谓逆转录，是指以所谓逆转录，是指以RNA为模板，利用宿主细胞中为模板，利用宿主细胞中4种种dNTP为为原料在引物的原料在引物的3端以端以5 3方向合成与方向合成与RNA互补的互补的DNA链的过程，链的过程，此 过 程 与 中 心 法 则 相 反 ， 故 称 为 逆 转 录 （此 过 程 与 中 心 法 则 相 反 ， 故 称 为 逆 转 录 （ r e v e r s e transcription）。在逆转录过程中以）。在逆转录过程中以RNA指导的指导的DNA聚合酶称聚合酶称为逆转录酶（为逆转

29、录酶（reverse transcriptnase）。实际上，逆转录并非转）。实际上，逆转录并非转录，而是一种复制形式，必须有引物存在才能完成。录，而是一种复制形式，必须有引物存在才能完成。第二节第二节 逆转录逆转录PCR （ reverse transcription PCR, RT-PCR）二、逆转录酶二、逆转录酶1970年年Temin在在Rous肉瘤病毒、肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中各在白血病病毒中各自发现了逆转录酶，以后发现所有自发现了逆转录酶，以后发现所有RNA肿瘤病毒中都含有逆肿瘤病毒中都含有逆转录酶。逆转录酶是逆转录病毒转录酶。逆转录酶是逆转录病毒RNA编码的，是编

30、码的，是多功能酶多功能酶：具有具有RNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性，能和其它，能和其它DNA聚合酶聚合酶一样，沿一样，沿5 35 3方向合成方向合成DNA，并需要引物提供，并需要引物提供3-OH3-OH ；具有具有RNA酶酶H（RNaseH）活性活性，能特异性水解，能特异性水解RNA-DNA杂交体上的杂交体上的RNA；具有具有DNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性，以逆转录合成的单，以逆转录合成的单链链DNA为模板合成互补为模板合成互补DNA链。链。 逆转录酶对逆转录酶对DNA没有没有3 5外切酶活性外切酶活性，因此它没有校，因此它没有校对功能，错误率相对较高。对功能，错误率

31、相对较高。细胞总细胞总RNARNA的检测的检测 1. Total RNA extracted from 293 transfected with pAd-CMV-E6/E7 2. Total RNA extracted from 293 transfected with pAd-K14-E6/E7 三、逆转录病毒合成三、逆转录病毒合成cDNA的基本过程的基本过程cDNA是指以是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下在体外反为模板，在反转录酶的作用下在体外反转录合成的双链转录合成的双链DNA（简称（简称cDNA)。 RNA5 5 335 5 33以以RNA为模板合成一小段为模板合成一小段cDNA

32、5 5 33反转录酶除去杂交双链中的反转录酶除去杂交双链中的RNA5 5 33单链单链DNA的合成的合成 引物第一次跳跃引物第一次跳跃3 3 55除去杂交链中的大部分除去杂交链中的大部分RNA引物引物逆逆转转录录过过程程R U5 PBPB U3 RR U5 PBR U5 PBPB U3 RPB U3 RPB U3 R U5 PBPB33合成一段双链合成一段双链DNA 引物第二次跳跃引物第二次跳跃55mRNA逆转录合逆转录合成成cDNA,引物采引物采用用Oligo dTU3 R U5 PBPB U3 R U5 U3 R U5 PB3 3 PB U3 R U5 PB合成一部分正股合成一部分正股DN

33、A3 3 PB U3 R U5 PB除去除去RNA四、四、RT-PCR的反应体系的反应体系MgCl24l（5m mol/L）Buffer2 l（1）dNTP混合物混合物8 l（1 mol/L ）RNase抑制剂抑制剂0.5 l（1u/ l ）反转录酶反转录酶1 l（0.25u/ l）随机引物混合物随机引物混合物1 l（2.5 mol/L ）总总RNA1 l（1 g）无无RNase的的dH2O至总体积至总体积20 l逆转录体系逆转录体系逆转录反应在逆转录反应在420C进行进行1h 后，加热至后，加热至950C5min，灭活逆转录酶。取，灭活逆转录酶。取2 l反应产物，按反应产物，按DNA为模板的

34、为模板的PCR反应步骤，进行扩增反应。反应步骤，进行扩增反应。 HPV-16 E6/E7HPV-16 E6/E7在转录水平的在转录水平的RT-PCRRT-PCR检测结果检测结果 1. Marker ：100bp DNA Marker ; 2. RT-PCR 产物：产物：E6/E7基因基因; 3. 阴性对照阴性对照 RT-PCR鉴定鉴定pAd-CMV-E6/E7 转染的转染的293细胞中细胞中E6/E7的表达的表达 DNA序列测定序列测定第三节第三节 DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内容。对容。对DNA一级结构的研究，有助于探索基因结构与功

35、一级结构的研究，有助于探索基因结构与功能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部遗传信息，正是遗传信息，正是人类基因组计划（人类基因组计划（human genome project, HGP)的最主要目标之一。的最主要目标之一。 将将DNA片段用荧光等分析仪，测出片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排序列碱基排列顺序。列顺序。 DNA 序列测定方法：序列测定方法：o1. Sanger的双脱氧法：的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。四个反应。o2

36、.化学降解法：化学降解法：G反应；反应；G+T反应；反应；T+C反应和反应和C反反应。应。o3.自动测序法。自动测序法。DNA 测序的主要方法有两种，即测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法（双脱氧链终止法（Sanger 法、酶促法）和化学裂解法（法、酶促法）和化学裂解法（Maxam-Gelbert 法）法）。二者。二者均依赖于均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。）。不管是酶促法还是化学法，都是分为不管是酶促法还是化学法，都是分为4个反应体系进行测序个反应体系进行测序反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置的反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置的A、T

37、、G或或C碱基。碱基。4种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影后，读出待测电泳，放射自显影后，读出待测DNA的连续序列。的连续序列。一、一、 Sanger 双脱氧链终止法双脱氧链终止法 （一）原理（一）原理(单链单链) DNA链中的核苷酸是以链中的核苷酸是以3，5-磷酸二酯键相连接，合成磷酸二酯键相连接，合成DNA所用的底物是所用的底物是2-脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTP），在），在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了双脱氧链终止法中被掺入了2，3-双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当当dd

38、NTP位于链延伸末端时位于链延伸末端时, 由于它没有由于它没有3- OH，不能再与其它的脱氧核苷酸形成不能再与其它的脱氧核苷酸形成3,5-磷酸二酯键，磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则，则新生链的末端就是新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入，依次类推可以通过掺入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，则新生链的末端为，则新生链的末端为T、C或或G，根据，根据这个原理，这个原理，Sanger与与1977年建立了双脱氧链终止测序法。年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得了诺贝尔奖。他本人也因此而获得了诺贝尔奖。

39、Sanger双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸互补链合成过程互补链合成过程 以单链或双链以单链或双链DNA为模板，采用为模板，采用DNA引物引导新生引物引导新生DNA的合成，因此又称为的合成，因此又称为引物合成法引物合成法，或，或酶促引物合成法酶促引物合成法。主要是基于主要是基于DNA聚合酶聚合酶的催化特性：以的催化特性：以DNA为模板，根为模板，根据碱基配对的原则逐个将据碱基配对的原则逐个将dNTP加到与模板结合的寡核苷加到与模板结合的寡核苷酸引物的酸引物的3-OH末端，末端，形成正确形成正确的模板的模板DNA互补链互补链；能；能以以dNTP作为底物，也作为底物，也能利用能利用ddNTP作底物

40、作底物，将其掺入寡，将其掺入寡核苷酸链的核苷酸链的3 末端而末端而终止新生互补链的延伸终止新生互补链的延伸。 如果在如果在DNA的合成反应中，除了加入的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核种正常的脱氧核苷三磷酸（苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的）外，再加入一种少量的2,3 ddNTP，那，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。 在在4组独立的组独立的DNA合成反应中，分别加入合成反应中，分别加入4种不同的种不同的ddNT

41、P，结果将生成，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终组核苷酸链，它们将分别（随机）终止于每一个止于每一个A，每一个，每一个G，每一个，每一个C，每一个，每一个T的位置上。对的位置上。对这这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。在测序反应中通常设置在测序反应中通常设置4个反应，各反应管中同时加入一种个反应，各反应管中同时加入一种DNA模板和引物、模板和引物、DNA聚合酶聚合酶I（失去失去5 3外切核酸酶活外切核酸酶活性性）、其中一管中分别加入）、其中一管中分别加入1种种 ddNTP （ 如如ddTTP、dTTP）以及以及4种种d

42、NTP（ dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP ），引物末），引物末端用放射性核素标记，端用放射性核素标记， ddTTP的比例很小（的比例很小（1:10），因此），因此掺掺入的位点是随机的入的位点是随机的，经过适当的条件下温育，将会有不同长，经过适当的条件下温育，将会有不同长度的度的DNA片段合成。它们都具有片段合成。它们都具有相同的相同的5末端末端，3末端都因末端都因掺入了掺入了ddTTP而以而以T结尾。在其它三管中同理加入相应的结尾。在其它三管中同理加入相应的ddNTP。 Sanger双脱氧测双脱氧测序方法示序方法示意图意图双双脱脱氧氧法法测测序序原原理理示示意意图图（1）鸟枪法鸟

43、枪法 将长链将长链DNA片段随机断裂成适于序列测定片段随机断裂成适于序列测定的片段（的片段（300-600bp），断裂方法有超声波处理、核酸酶），断裂方法有超声波处理、核酸酶I法和限制酶切割法。法和限制酶切割法。（2）嵌套缺失法嵌套缺失法（nested deletion,Erase-a-base）首先将大片段克隆到测序载体；首先将大片段克隆到测序载体；选用两种限制酶从待测选用两种限制酶从待测DNA片段与载体序列之间将片段与载体序列之间将DNA切断切断,使切割后近载体端为使切割后近载体端为3突出的粘性末端，近待突出的粘性末端，近待测测DNA的末端为的末端为5突出的粘性末端或平端；突出的粘性末端或

44、平端； 大片段大片段DNA序列测定的策略序列测定的策略 用外切核酸酶用外切核酸酶III消化上述线性消化上述线性DNA（37 C，250核苷酸核苷酸/min），在不同时间终止反应，可以获得在同一端缺失并依），在不同时间终止反应，可以获得在同一端缺失并依次相差次相差200-250bp的的DNA片段。片段。用核酸酶用核酸酶S1消化末端的单链，使之成平端，经消化末端的单链，使之成平端，经T4 DNA连连接酶连接环化，得到一套缺失长度不同的接酶连接环化，得到一套缺失长度不同的DNA片段克隆；片段克隆；将各个克隆从其缺失端开始用通用引物测序。由于引物相将各个克隆从其缺失端开始用通用引物测序。由于引物相同，

45、测序结果可以从子片段序列的相互重叠部分准确无误地同，测序结果可以从子片段序列的相互重叠部分准确无误地将相邻片段的序列拼接起来。将相邻片段的序列拼接起来。引物引物EB目的片段目的片段BEBamH I 53Exo IIIS1T4 ligasetttgggcccaaa atcggggctgggcatagttttgggcccaaa ggcatagt.cgatcagtttgggcccaaa cgatcagcg.tcagtcgtagtttgggcccaaa tcagtcgtagcgtagcta.gggaa引物引物拼接方向拼接方向测序测序每次测序的长度是有限的每次测序的长度是有限的（3）引物延伸法）引物延伸

46、法 从从DNA的的3端依赖特定引物延伸测定一段端依赖特定引物延伸测定一段DNA序列，再根据序列，再根据测得序列设计新的引物，如此逐步推进。测得序列设计新的引物，如此逐步推进。 一轮一轮随机引物随机引物 作为二轮的引物作为二轮的引物测出的序列测出的序列二轮二轮三轮三轮 几乎与双脱氧链终止法建立的同时，几乎与双脱氧链终止法建立的同时，Maxam和和Gilbert于于1977年建立了一种以化学修饰为基础的年建立了一种以化学修饰为基础的DNA序序列分析法，称为列分析法，称为Maxam-Gilbert化学修饰法。化学修饰法。二、二、Maxam-Gilbert化学修饰法化学修饰法（一）（一） Maxam-

47、Gilbert化学修饰法原理化学修饰法原理基本原理基本原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNADNA片段，片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的的DNADNA链的反应混和物，经凝胶电泳按大小分离和放射自链的反应混和物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影，便可根据显影，便可根据X X线片底板上显示相应带谱，直接读出待线片底板上显示相应带谱，直接读出待测测DNADNA片段的核苷酸顺序。片段的核苷酸顺序。 化学修饰法的化学修饰法的待测待测DNA片段有的是双链，有的是单链片段有的是双链，有的是单链

48、DNA。在进行碱基特异性化学切割反应前，首先对待测在进行碱基特异性化学切割反应前，首先对待测DNA片段作末端标记，使其末端片段作末端标记，使其末端(5端或者是端或者是3端端)带上放射带上放射标记。标记。如果待测如果待测DNA是双链，必须使其形成末端标记的单是双链，必须使其形成末端标记的单链。链。对末端标记的对末端标记的DNA链进行化学断裂反应分两步进行：链进行化学断裂反应分两步进行：第一步第一步是在是在4个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲和甲酸酸对特定的碱基进行化学修饰对特定的碱基进行化学修饰；第二步是以六氢吡啶第二步是以六氢吡啶取代取代被修饰的碱基并将

49、被修饰的碱基并将DNA链链断裂断裂。DNA化学裂解反应体系化学裂解反应体系反应体系反应体系 碱基修饰试剂碱基修饰试剂 碱基修饰反应碱基修饰反应 主链断裂试剂主链断裂试剂 断裂点断裂点G 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶六氢吡啶 GG+A 甲酸甲酸 脱嘌呤作用脱嘌呤作用 六氢吡啶六氢吡啶 G和和AC+T 肼肼 嘧啶开环嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 C和和TC 肼（加盐）肼（加盐） 胞嘧啶开环胞嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 C DMS（硫酸二甲酯）在（硫酸二甲酯）在中性中性pH环境中，主要环境中，主要作用于作用于G，被六氢吡啶作用而造成，被六氢吡啶作用而造成该位点上该位点上DN

50、A链的断裂。链的断裂。 甲酸甲酸具有脱嘌呤作用。具有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点链在脱嘌呤位点(G和和A)发生断裂。发生断裂。 肼肼，在，在碱性条件下，作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶碱性条件下，作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶，在具有六氢吡啶的条件下，导，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个核苷酸位置上发生致在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果在反应体系中加入链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的盐高浓度的盐，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于胞嘧啶胞嘧啶。在化学修饰反应过程中，通过在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间控制反应温度和反应时间，只，只有有一小部分碱基被修饰一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰而不是全部被修饰)，随后进行的断，随后进行的断裂反应也是裂反应也是定量反应定量反应。因此，。因此，DNA链并不是在所有可被修饰链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是的碱基位点断裂，而是随机断裂随机断裂。在。在4个反应中，产生个反应中，产生4套带套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末只有带标记末端的片段可被识别端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。，没有标记末端