多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析

1、多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析李立宏高国栋王学廉张宝国【关键词】超微结构关键词：超微结构；PC12细胞；凋亡；帕金森病；多巴胺摘要：目的研究帕金森病（PD多巴胺能神经元的死亡机制.方式在免疫组织化学基础上，采纳流式细胞仪、电泳及电镜技术观看不同浓度多巴胺（DA诱导大鼠嗜铭细胞瘤PC1N田胞凋亡的超微结构及生化改变.结果适当浓度DA可诱导PC12细胞凋亡.初期表现为线粒体结构及功能的改变并有抗凋亡蛋白bcl-2的表达，后期电镜下可见凋亡特点性核结构改变及典型的DNA“阶梯状”电泳带.结论细胞凋亡参与了PD的病变进程，线粒体在初期细胞凋亡中起着重要的调剂作用.Keyword

2、s:ultrastructure;PC12cells;apoptosis;Parkinson'sdisease;dopamineAbstract:AIMTostudythemechanismofdopaminergicneuronaldeathofParkinson'sdiseases（PD.METHODSsingtheflowcytometry,electronmicroscope,elec-trophoresisandtheimmunohistochemistrytechnology,weobservedthealterationofultrastructureandbio

3、chemistryoftheapoptosisonPC12cellsinducedbydopaminewithdiffer-entModerateconcentrationsofdopamine(DAinducedapoptosisinearlyal-terationwasthatofstructureandfunctionofmitochondrionandtheexpressionofbcl-2anti-apoptosisthespecificnuclearultrastructureofapoptosisandthetypicalDNA“ladder“electrochromatogra

4、phywereiCLUSIONApoptosismaybeinvolvedinthepathogenesisofPRandthemitochodriaplaysasignificantroleintheearlyapoptosisofcells.0引言帕金森病的特点性病理改变成黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性死亡、缺失.其具体机制迄今尚不完全明确，目前以为PD患者脑内氧化应激反映过强，致使脑内神经递质多巴胺异样代谢产生过量的反映性氧自由基在其中起重要作用1.细胞凋亡是致病因子或异样信号诱导发生的“生理性”的主动细胞死亡进程.它可能参与了PD的发病进程2,3.PC12细胞株做为一种儿茶酚胺类细胞

5、株，被普遍应用于神经细胞死亡方式及毒性损害研究.咱们要紧观看多巴胺(DA诱导PC12细胞凋亡的初期超微结构转变，以探讨细胞凋亡在PD的发病机制中的作用.1材料和方式细胞培育PC12细胞株（购于中国科学院上海细胞生物研究所）置于RPMI-1640培育液中，内含200mL・L-1胎牛血清，谷氨酰胺2mmol・L-1,青霉素50ku・L-1,链霉素25mg・L-1,培育瓶中预先铺以200mg・L-1鼠尾胶，用于细胞传代，置于50mL・L-1CO2孵箱37c培育，隔天换液

6、.药物处置待PC12细胞生长良好时加入多巴胺・L-1,同时将部份细胞置于培育皿中，进行细胞爬片.空白对照组加入RPMI-1640培育液.别离培育12及24h.形态学观看别离取・L-1多巴胺培育12h及24h的细胞片，福尔马林固定30min,・L-1PBS缓冲液洗涤3次，每次5min,HE染色光镜下观看.流式细胞仪检测别离取・L-1DA处置12及24h的细胞液经・L-1胰酶和・L-1EDTA夜消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度1X109・L-1,

7、离心后弃去上清液，重悬浮于5mL4c预冷的葡萄糖盐水中，按每1mL液加入2mL4C冷乙醇的量固定24h,按1：1加入碘化丙咤（PI）染色，4c放置25min,流式细胞仪中进行分析.免疫组织化学bcl12染色应用SABC试剂盒，将细胞片置于30mL・L-1H2O2中常温处置10min;蒸镭水洗涤3次;加入血清封锁液20min;加入bcl-2抗体37C1h;・L-1PBS洗涤3次；加入生物素化二抗37c20min;PBS洗涤3次;加入SABC试剂37c20min;PBS洗涤4次;DAB显色；苏木素轻度复染，脱水封片镜检.电镜检查别离将&#1253

8、9;L-1DA处置12及24h的细胞悬液离心后弃去上清，加入30mL・L-1戊二醛固定30min,送电镜室做超薄切片，JEM-2000EX®透射电镜下观看照相.DNA凝胶电泳别离取・L-1DA处置12及24h的细胞液，调整细胞浓度5X109・L-1,裂解液裂解，RNAase蛋白酶K孵育，酚抽提，乙醇沉淀，每样品提取DNA10g经琼脂糖凝胶行电泳分析.2结果形态学观看・L-1多巴胺作用12h细胞H磔色形态学无明显改变，可见核割裂相减少（1个/HP）.24h那么呈典型凋亡形态学改变，可见凋亡小体.空白

9、对照组细胞生长旺盛，核割裂相明显（6个/HP）.流式细胞仪检测・L-1多巴胺作用PC12细胞12h时流式细胞仪检测未见凋亡峰，但同空白对照组比较“S”期细胞明显下降，由%邛为%说明细胞增殖明显抑制.而・L-1多巴胺作用PC12细胞24h时流式细胞仪检测可见典型亚二倍体凋亡峰（AP）,凋亡率为（Fig14）.图1图4略免疫组化bcl2表达在・L-1多巴胺作用的PC12细胞中，不管12h仍是24h光镜下都可见部份细胞胞质呈棕黄色，有棕黄色颗粒（bcl-2阳性细胞），部份细胞胞质呈淡紫色（阴性细胞）.但12h表达阳性率明显高于24h,

10、呈强阳性，以后慢慢下降.而空白对照组胞质均为淡紫色未见bcl-2表达，细胞生长旺盛（Fig5）.电镜检查・L-1DA作用PC12细胞12h时电镜下未见明显凋亡特点性核改变，细胞形态稍有转变，可见线粒体肿胀、峭不明显及内质网扩张.而24h那么可见典型核结构改变：即核浓缩及凋亡小体.空白对照组细胞及细胞器形态正常，可见核割裂相（Fig6,7）.电泳分析24h条件可见典型“阶梯样”DN彝解片段，而空白对照组及12h组无此转变（Fig8）.3讨论目前PD的临床药物医治主若是左旋多巴（L-dopa）类药物替代疗法，通过补充外源性DA来弥补脑内多巴胺的不足，减缓临床病症.但最近几年来

11、研究以为DA可能对PD患者残余的多巴胺能神经元具有损伤作用，从而加速PD的进展进程1.细胞凋亡是致病因子或异样信号诱导发生的“生理性”的主动细胞死亡进程.这是一种受基因调控的特殊类型的细胞死亡.最近几年来研究发觉PD患者多巴胺能神经元在形态学上呈凋亡样改变，提示细胞凋亡可能参与了PD的发病进程2 .PC12细胞做为一种儿茶酚胺类细胞，其胞质中含有大量嗜铭颗粒，富含合成及分解多巴胺所必需的酶类（如TH,DGMACSCOMT等），在有神经生长因子存在的培育条件下可分化为交感神经元样细胞，使其在形态、生理及生化功能等方面更接近神经元.被普遍应用于神经元死亡方式及毒性损害的研究，专门是PD的研究，为国

12、内外研究PD的常见的细胞模型4.图5图8略许多实验说明多巴胺可诱导PC1N田胞凋亡，且在必然范围内这种凋亡呈剂量及时刻依托性，以・L-1多巴胺诱导的凋亡率为最高3.其12h流式细胞仪虽未见明显凋亡峰，但可见细胞生长“S”期明显呈抑制状态，现在bcl-2染色呈强阳性，说明细胞正在动用自身调剂机制对抗凋亡.24h那么可见明显凋亡峰，凋亡率为%现在bcl-2染色强度较12h明显下降，说明细胞凋亡已不可逆转.bcl-2蛋白作为BCL-2家族中起抗凋亡作用的一种蛋白，要紧定位于线粒体外膜，本实验中在电镜及电泳尚未显现凋亡典型的核结构改变时，在凋亡初期12h内即有bcl-2的表达，这

13、说明初期的凋亡同线粒体有重要联系.最近几年来线粒体在凋亡中的重要作用日趋引发人们的普遍关注.Guideok等研究发觉多种因素诱导细胞显现凋亡特点性细胞核改变之前，都可观看到线粒体跨膜电位（0力的下降，提示m下降是凋亡的初期特点.其要紧功能是维持细胞正常的通透性.bcl-2做为一种抗凋亡作用的蛋白质，主若是通过稳固m阻止线粒体细胞色素C的释放、抑制Ca2+的外流及自由基的形成等机制来维持线粒体结构及功能稳固性，从而发挥其抗凋亡作用的5.进一步研究发觉当线粒体细胞色素C释放后，bcl-2那么不能阻止细胞凋亡的发生，说明bcl-2对凋亡的调控部位在线粒体，而后者的结构和功能的改变是凋亡细胞超微结构的

14、初期转变.最近研究发觉PD患者黑质纹状体细胞线粒体内复合物I缺点6,从而致使其通透性增加对自由基损伤加倍灵敏，ATP合成障碍，引发DA能神经元死亡，这与本实验研究有相同的地方.在本实验中，当DA作历时刻进一步延长（>12h）,致使线粒体细胞色素C释放、bcl-2表达量下降、能量代谢障碍功能丧失时,说明凋亡已不可逆转.现在电镜下可见典型凋亡细胞超微结构改变：染色体浓缩并聚积在核膜周围形成新月样结构、核浓缩，随之显现核碎裂及凋亡小体形成等7.DNA电泳那么可见典型“阶梯状”“阶梯状”DNA电泳主若是由于凋亡细胞自身的核酸内切酶被激活，引发自身DNAt降解成180200bp的寡核甘酸片

15、段而形成的，在流式细胞仪检测时那么表现为亚二倍体凋亡峰(AP).关于PD患者黑质多巴胺能神经元具体死亡机制迄今尚未完全明了，目前以为与PD患者脑内氧化应激反映增强，加速了DA的氧化，产生过量的反映性自由基紧密相关.在脑内DA既可通过自身氧化亦可通过MAO-B1氧化产生大量超氧自由基、H2O2及高毒性的羟自由基等产物，诱导神经元发生死亡8.同时最新研究发觉PD患者黑质部位还原型GSHK谷胱甘肽超氧化物酶减少约50溢右，致使该区域神经元爱惜功能明显减弱9.因此咱们以为初期利用MAO-B抑制剂及抗氧化类神经元爱惜剂有助于PD的医治，延缓病程进展.参考文献：1 OlanowCWMDFRreaction

16、sinParkinson'sdiseaseJ.Neurology,1990;40(Suppl3):32-37.2 ShawMKYuasacelldeathinneuronalPC12cellsismediatedbyinductionofapoptosisJ.Neuro-science,1994;63(3):975-987.3 TanakM,SotomatSAKanaiH,StoneJM,HeronDopaminecausecultureneuronaldeathinthepresenceofironJ.JNeurolSci,1991;101(1):198-203.4 LoydA,Gr

17、eeneofanoradrenergiccoloniallineofratadrenalpheochromocytomacellswhichrespondtonervegrowthfactorJ.ProcNatlAcadSci,1976;73(7):2424-2428.5 OltvaiZN,MillimanCL,KorsmeyerinvivowithaconservedhomologyBaxthatacceleratespro-grammedcelldeathJ.Cell,1993;74(3):609-612.6 SchapiraAHVCooperJM,DexterD,CarterCJ,WellscomplexIdeficiencyinParkinson'sdiseaseJ.Lancet,1989;32(2):1269-1276.7 RoyS,WolmanobservationsinParkinson'sdiseaseJ.JPathol,1969;99(5):39-43.8