大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响

1、精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响作者：寇晨光曹成波燕晓雯罗兵周岩冰【摘要】目的观察大鼠肝实质细胞与Kupffer细胞体外共同培养时对两者生长、形态及功能的影响。方法采用原位二步IV型胶原灌注法、Percoll液密度梯度离心法分离Wistar大鼠肝实质细胞与Kupffer细胞;体外将肝实质细胞与Kupffer细胞按6：1比例共同培养。观察不同情况下肝细胞生存时间和形态，每隔24h检测培养上清液中清蛋白和谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的水平，并在培养36h用放免法检测上清液中白细胞介素1（IL拟1）

2、、白细胞介素6（IL拟6）、肿瘤坏死因子a（TNF拟a）精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载1精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载含量。结果单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速，并向正常肝细胞的形态演变，肝细胞可培养存活至15d;共同培养组肝细胞生长增殖缓慢，细胞可培养存活至10d。共同培养组上清液中清蛋白水平在24、36、48、60h比单独培养组低（t=P）;ALT、AST水平在24、36、48、60h比单独培养组高（t=，P）;共同培养组Kupffer细胞保持IL拟1、IL拟6、TNF拟a分泌功能，而单独培养组未检测到IL拟1、IL拟6、TN

3、F拟由结论大鼠Kupffer细胞和肝实质细胞在适宜的培养条件下可进行共同培养，二者可以保持良好的分泌功能，可用于实验研究。【关键词】肝细胞;枯否细胞；共同培养技术;清蛋白类;细胞因子类；大鼠ABSTRACTObjectiveToobservethegrowth,morphology,andfunctionofhepatocyteswhenculturedinvitrowithKupffercellsinrats.MethodsIn拟situK精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载2精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载collagenasetwo

4、拟stepperfusionmethodandlowspeedgradientcentrifugtionbypercollfluidwereusedtoisolateparenchymalhepaticcells(PHC)andKupffercellsinWistarrat,respectively.CocultivationofPHCandKupffercellswasdoneinvitroaccordingto6：1ratio.Thelivetimeandformofthecellsunderdifferentcircumstanceswereobserved.ALTandASTlevel

5、sinculturesupernatantweredetectedat24以hour拟interval,andtheconcentrationofIL拟1,IL拟6andTNF拟ameasiedbyradioimmunoassayat36hours.ResultsInsolitary拟culturegroup,thehepatocytesgrewquicklyanddeve拟lopedtotheformofnormallivercells,whichcouldsurvive15days;forthoseinco拟culturegroup,thecellsgrew精选公文范文，管理类，工作总结类

6、，工作计划类文档，感谢阅读下载精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载andgeneratedslowly,whichsurvived10days.Thelevelsofalbumeninsupernateofco拟culturegroup,at24h,36h,4and60h,werelowerthanthatinsolitary拟culturegroup(t=,P),andthatofALTandAST,atthesametimepointsasabove,werehigher(t=,P).Inco拟culturegroup,thesecretoryfunctionof

7、IL拟1,IL拟6,andTNF拟wasretained,andinsolitary拟culturegroup,noIL拟1,IL拟6,andTNF拟wweredetected.ConclusionHepatocytesandKupffercellsofratcanbeculturedtogetherunderasuitablecondition,andthefavourablesecretoryfunctionofthecellsbemaintainedforempiricalstudy.KEYWORDShepatocyte;Kupffercell;coculturetechnique;al

8、bumins;精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载cytokines;rats肝细胞分离、培养是研究肝脏和肝细胞的良好方法。尽管肝细胞在体内拥有相当强的增殖能力，但要肝细胞在体外保持分化状态且能继续增殖却非常困难。要明确影响肝细胞生长、分化和死亡的因素等，仍然面临认识水平和技术的挑战。实验已证实，肝实质细胞与非肝实质细胞或非肝细胞的共同培养可有效延长肝细胞的生存时间，促进肝细胞增殖；有助于保持细胞间特有的胆管结构，促进形成缝隙连接；可促进肝细胞的合成和分泌功能；有助于肝细胞维持其解毒功能1拟4。目前进行的共

9、同培养主要有肝细胞拟非肝细胞培养或肝实质细胞拟非实质细胞培养，而对肝细胞与Kupffer细胞的共同培养的报道还较少。本实验在体外将肝实质细胞与Kupffer细胞共同培养，观察体外联合培养体系中肝细胞形态、生长情况、功能的变化精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载以及Kupffer细胞细胞因子分泌情况，旨在为肝细胞在病毒学、免疫学、药理学及肝细胞移植等方面的研究提供良好的平台。1材料与方法材料雄性Wistar大鼠6只，体质量180200g,SPF级，青岛市药物检验所实验动物中心提供。RPMI拟1640完全培养基

10、购于中国医学科学院生物医学工程研究所;W型胶原酶、g/L胰酶、锥虫蓝均购于美国Sigma公司;Percoll液购自于北京华美公司；考马斯亮蓝G拟250、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒均杭州博日生物技术有限公司提供;125I肿瘤坏死因子拟a(TNF以a放射免疫分析试剂盒、125I白细胞介素1(IL拟1)放射免疫分析试剂盒、125I白细胞精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载介素拟6（IL拟6）放射免疫分析试剂盒均购自北京普尔伟业生物科技有限公司。方法肝细胞及Kupffer细胞的分离参照S

11、MEDSROD等5方法加以改良分离收集肝细胞，利用Percoll液密度梯度离心法收集Kupffer细胞。肝细胞和Kupffer细胞的培养及观察单独培养组调整肝细胞密度至X108/L并接种到培养皿，置于含体积分数CO2孵箱，在37C、100%湿度条件下培养，12h后更换新鲜培养液。共同培养组将肝细胞按X108/L的细胞密度、Kupffer细胞按X107/L细胞密度（6：1）共同接种于培养皿，置于含体积分数CO2孵箱，在37C、100%湿度条件下培养，12h后更换新鲜培养液。每培养12h更换培养液并吸取上清液用全自动生化检测仪检测清蛋白、ALT、AST、IL拟1、IL拟6、TNF拟%并观察细胞形态

12、及生长情况。精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载检测指标采用考马斯亮蓝G拟250方法测定清蛋白，采用ELISA法分别检测上清液中ALT、AST、IL拟1、IL拟6及TNF拟a含量统计学处理采用PPMS软件6进行统计学处理，数据以“表示，组间比较用两样本均数t检验。2结果形态学观察倒置显微镜下，新分离的大鼠肝细胞晶莹透亮，呈圆球形，折光性强，有立体感。台盼蓝染色计数显示健康肝细胞的比例平均为92%。同时，新分离的Kupffer细胞胞浆透亮，多呈圆球形，少数呈多形性，散在分布，大小不一致，约6h后，细胞开始伸展

13、,体积增大,h后细胞充分展开，呈典型的星形或多边形，边界不清。在单独培养组，肝细胞的生长、增殖较共同培养组的细胞迅速，精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载接种4h后肝细胞贴壁、伸展，连接成条索状;24h后绝大多数肝细胞贴壁，呈扁平状，体积明显增大；4h后肝细胞贴壁牢固，细胞开始增殖，细胞间出现岛状连接，部分肝细胞呈双核；72h后肝细胞开始增殖，在原来肝细胞周围出现透明且体积较小的上皮样细胞，呈多边形，逐渐铺满培养皿底；10d后培养液的上清中悬浮细胞逐渐增多，细胞开始大量死亡;至培养15d时细胞全部死亡。在共

14、同培养组，24h后绝大多数肝细胞贴壁，呈扁平状，体积增大；肝细胞生长增殖缓慢，于96h即开始出现少量的死亡细胞漂浮，至培养10d时细胞基本全部死亡。功能测定共同培养组清蛋白水平在24、36、48、60h低于于单独培养组（t=，P）;共同培养组ALT、AST水平在24、36、48、60h明显高于单独培养组（t=，P）;培养36h后，共同培养组上清液中IL拟1为（士）Ng/LL拟6为（士）ng/LTNF拟精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载9精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载a为(z)pmol/L,而单独培养组未检测到上述细胞因子。见表13。表

15、1各组大鼠肝细胞上清中清蛋白水平比较(p/g-1沙4)组另Un24h36h48h60h单独培养组上山共同培养组6d*寸圭土与单独培养组比较，*t=，PO表2各组大鼠肝细胞上清中ALT水平比较(z/UL-1,ds)组另ijn24h36h48h60h单独培养组共同培养组6至寸土士与单独培养组比较，*t=，Po表3各组大鼠肝细胞上清中AST水平比较(z/UL-1,ds)组另ijn24h36h48h60h单独培养组共同培养组6寸*士与单独培养组比较，*t=，Po3讨论肝细胞的分离及形态功能观察肝细胞是肝脏最主要的实质细胞类型，正常生理状况下占60%。肝细胞完成肝脏的绝大部分功能，是肝脏的主要效应细胞，

16、同时也是生物及化学损伤的主要靶点。肝细胞性状的生物学检测，精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载10精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载包括形态和功能两方面。研究发现，细胞接种2h后就开始贴壁，20h后约有；0%的细胞贴壁，细胞贴壁后开始变平变薄，可见双核细胞和多核细胞，部分细胞开始小范围的呈岛状连接;48h变化更明显，整个细胞变薄并向四周拉平，细胞形成岛状连接成片，可见许多双核细胞和多核细胞；培养1周后可见少量的新生细胞，透亮，胞浆与胞核的区别不很明显;培养2周后，可见大量的新生细胞，也呈岛状生长，极具立体感7拟8。Kupffer细胞在机体防

17、御和肝细胞损伤中的作用Kupffer细胞寄居于肝血窦内皮细胞之间或之上，是体内固定型巨噬细胞中最大的群体，占巨噬细胞总数的；0%90%,约占肝细胞总数的15%9。Kupffer细胞的主要生理功能包括吞噬和清除功能，能吞噬和清除进入肝脏有害于人体的外来抗原、某些有害物质以及分泌前列腺素和氧化类物质，杀灭肿瘤细胞。精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载11精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载以往研究发现，牛磺酸和支链氨基酸对四氯化碳所致的肝细胞损伤具有保护功能，其保护作用可能是通过抗脂质过氧化作用实现的10。在病理情况下，多种因素致使Kupffer

18、细胞活化，活化后其功能则明显增强，可合成和分泌多种生物活性物质，释放的大量促炎递质如TNF拟a、IL拟1、IL拟6、IL拟8、氧自基、一氧化氮以及花生四烯酸代谢产物等，能够参与机体的炎症反应和免疫反应，导致和加重肝细胞的损伤11。Kupffer细胞能够通过表达FasL,与肝细胞表面的Fas直接结合，诱导肝细胞凋亡12。Kupffer细胞还能募集中性粒细胞和淋巴细胞进入肝组织，加重肝细胞损伤。鉴于Kupffer细胞在肝脏功能中的重要作用，建立适宜的肝细胞Kupffer细胞体外培养体系，对于进行肝细胞移植、肝细胞功能和药物代谢等的研究有重要意义。本实验Kupffer细胞生长良好，保持IL拟1、IL拟6、TNF拟a等细胞因子精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，感谢阅读下载12精选公文范文，管理类，工作总结类，工作计划类文档，欢迎阅读下载分泌功能。共同培养体系中Kupffer细胞对肝细胞影响共同培养体系即是将两种细胞（可以来自同一组织，亦可以来自不同的组织）混合共同培养，从而使其中一种细胞的