土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离分离与与计数计数尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2 重要的农业氮肥。重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为只能被土壤中细菌分解为NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用 CO(NH CO(NH2 2) )2 2 + H + H2 2O COO CO2 2 +2NH+2NH3 3细菌脲酶细菌脲酶一、课题背景一、课题背景二、研究思路二、研究思路 （一）筛选菌株（一）筛选菌株 提出的问题提出的问题 如何寻找如何寻找耐高温耐高温的酶？的酶？ 解决问题的思路解决问题的思路 寻找寻找耐高温耐高温环境；环境； 原理原理 高

2、温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌， 耐高温菌种提取耐高温酶。耐高温菌种提取耐高温酶。选择培养基选择培养基（二）统计菌落数目：（二）统计菌落数目： 1 1、活体计数法（、活体计数法（稀释涂布平板稀释涂布平板） （1 1）操作方法：）操作方法： 稀释涂布平板稀释涂布平板统计菌落数统计菌落数 （2 2）原理：）原理： 1 1个菌落个菌落1 1个活菌个活菌 （3 3）统计原则）统计原则 选选 3030 300 300 个菌落的平板统计个菌落的平板统计 每个稀释度取每个稀释度取3 3个平板取个平板取其其平均值平均值 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同例：两位同学用稀释涂布平板

3、法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为菌落数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，三个平板，统计的菌落数分别为统计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三，该同学以这三个平板上菌落数的平均值个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？

4、如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？错在哪？ 甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目 1 1、活菌计数法、活菌计数法 （4 4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目际数目低低，因此统计结果一般用菌落数表示。，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数= =（C/V)C/V)* * M M C: C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；某一稀释度下

5、平板上生长的平均菌落数； V: V:所用稀释液的体积；所用稀释液的体积；M:M:稀释倍数。稀释倍数。2 2、显微镜直接计数、显微镜直接计数 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为过程中，从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，的培养基中，A A、B B两同学分别得到以下两种统计结果。两同学分别得到以下两种统计结果。 1 1、A A同学筛选出同学筛选出150150个菌落。个菌落。 2 2、B B同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。 B B认为认为A A的培养基被杂菌污染了，或培养基的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，

6、因而导致不能分解尿中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。素的细菌也能在该培养基中生长。A A确认自己确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助请你帮助A A同学改进实验，提供具有说明同学改进实验，提供具有说明了的证据。了的证据。 设置对照设置对照同等条件下，培养空白培养基同等条件下，培养空白培养基四、实验过程四、实验过程 （一）土壤取样（一）土壤取样 1 1、天然培养基和合成培养基：、天然培养基和合成培养基： 2 2、土壤取样：、土壤取样： （1 1）取样的位置：）取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的

7、微生物，土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中其中7070 9090是细菌。在富含有机质的土壤是细菌。在富含有机质的土壤层的层的3 3 8cm8cm处中分布着绝大多数的细菌。处中分布着绝大多数的细菌。 （2 2）取样要求：铲去表层土。）取样要求：铲去表层土。 菌落计数菌落计数配制土壤溶配制土壤溶液液系列稀释系列稀释涂布平板与涂布平板与培养培养（二）样品稀释（二）样品稀释 （1 1）测细菌数：一般用）测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液 （2 2）测放线菌：一般用）测放线菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液 （3 3）测真菌

8、数：一般用）测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液原则：确保平板上的菌落数在原则：确保平板上的菌落数在3030 300300之间。之间。（三）微生物的培养与观察（三）微生物的培养与观察 1 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2 2、培养：细菌：、培养：细菌：3030 3737，1 1 2d;2d; 放线菌放线菌:25:25 28, 528, 5 7d;7d; 霉菌霉菌: 25: 25 28, 328, 3 4d.4d. 3 3、观察：、观察：a.a.每每24h24h统计一次菌落数目统计一次菌落数目 b.b.以以“稳定稳定菌落

9、菌落”为观察对象为观察对象 （四）鉴定：筛选后必鉴定（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物鉴别培养基：不影响微生物的生存的生存 酚红培养基：酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分原理：脲酶催化尿素分解成氨解成氨培养基碱性增强培养基碱性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性(1)作样品系列稀释液作样品系列稀释液 (2)用适当的稀释液涂布平板用适当的稀释液涂布平板 在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。特征。 关注菌落

10、的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质形态、大小、边缘、突起、颜色、质地地等等，都是区分细菌的重要手段。等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。 1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物

11、大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素C CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板

12、的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）加入（） A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B

13、.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C巩固练习巩固练习(2016四川卷四川卷) 图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。部分序列。（1 1）图中选择培养基应以）图中选择培养基应以 为唯一氮源；鉴别为唯一氮源；鉴别培养基还需添加培养基还需添加 作指示剂，产脲酶细菌在该培作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成 色。色。尿素尿素酚红酚红红红(2016四川卷四川卷)

14、图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。部分序列。（2 2）在）在5 5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为10105 5 的土的土壤样品液壤样品液0.1mL0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为数分别为1313、156156、462462、178178和和191191。 该过程采取的接种方法是该过程采取的接种方法是 ，每克土壤，每克土壤样品中的细菌数量为样品中的细菌数量为 10108 8个；与血细胞计数板计数个；

15、与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较法相比，此计数方法测得的细菌数较 。稀释涂布平板法稀释涂布平板法1.75 少少 (2016四川卷四川卷) 图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。部分序列。 （3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了在图乙箭头所示位置增加了70个核苷个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和和UAA）。突变基因转

16、录的）。突变基因转录的mRNA中，终止密码中，终止密码为为 ，突变基因表达的蛋白质含，突变基因表达的蛋白质含 个氨基酸。个氨基酸。UGA115 空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaClNaCl、X X、H H2 2O O）; ;制作无菌平板；制作无菌平板；设置空白

17、对照组和若干实验组，进行相关操作；设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作； 将各组平板置于将各组平板置于3737恒温箱中培养一段时间，统计各组恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。平板上菌落的平均数。 回答下列问题回答下列问题: :（1 1）该培养基中微生物所需的氮来源于）该培养基中微生物所需的氮来源于_。若要完成步骤，该培养基中的成分若要完成步骤，该培养基中的成分X X通常是通常是_。（2 2）步骤中，实验组的操作是）步骤中，实验组的操作是_ _ 。牛肉膏、蛋白胨牛肉膏、蛋白胨琼脂琼脂 将各实验组平板分别将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间放置在教室不

18、同高度的位置上，开盖暴露一段时间 （3 3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为3636个个/ /平板，而空白对照组的一个平板上出现了平板，而空白对照组的一个平板上出现了6 6个菌落，这种个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了结果说明在此次调查中出现了_现象。若将现象。若将3030（即（即36366 6）个）个/ /平板作为本组菌落数的平均值，该做法平板作为本组菌落数的平均值，该做法_（填（填“正确正确”或或“不正确不正确”）。）。不正确不正确培养基被污染培养基被污染 某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：问题：（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用）分离纯化乳酸菌时，首先需要用_对泡菜对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是滤液进行梯度