尾巨桉再生体系的建立——李桂英

1、尾巨桉再生体系的建立李桂英湛江师范学院生命科学与技术学院， 湛江 524048摘要：以尾巨桉（DH32-29）无性系无菌苗的茎段为外植体，进行了组织培养实验，研究了具分化潜力的愈伤组织的获得、不定芽的分化、不定芽伸长、生根培养，建立了从愈伤到再生植株的再生体系。通过对多种生长调节剂不同浓度组合进行对比，确立了尾巨桉无性系再生体系的适宜培养条件：（1）愈伤组织诱导培养基：MS + IAA 0.05 mg/L + LC 2.0 mg/L + Vc 100 mg/L + 蔗糖 30g/L + 琼脂 7g/L（pH 5.8-6.0）；（2）不定芽诱导培养基：MS + NAA0.05 mg/L + 6-

2、BA 1.0 mg/L + 腐胺500mol/L + 亚精胺 100mol/L + Vc 100mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 7 g/L（pH 5.8- 6.0）；（3）不定芽伸长培养基：1/2 MS + NAA 0.05 mg/L+ LC 0.8 mg/L + Vc 100 mg/L +蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L（pH 5.8-6.0）；（4）生根培养基：1/2MS + IBA 0.5 mg/L + Vc 100 mg/L+ 蔗糖30 g/L + 琼脂）。关键词：尾巨桉；再生体系；组织培养Establishment of the Regeneration Syste

3、m for Eucalyptus grandis ×EucalyptusurophyllaLi GuiyingLife Science and TechnologySchool, ZhanjiangNormalUniversity, Zhanjiang524048Abstract:Using the stem segments of Eucalyptus urophyllaSterile clones as explants, the regeneration system from callus to regeneration plants was established by c

4、onducting tissue culture experiments and obtaining callus with differentiation potential, differentiation of adventitious buds, adventitious shoot elongation and rooting.The optimumculture conditions for the Eucalyptus urophylla clone regeneration system were obtained by comparing the variety of com

5、binations of different growth regulators:(1)Callus induction culture media:MS + IAA 0.05 mg/L + LC 2.0 mg/L + Vc 100 mg/L + Sucrose 30 g/L + Agar 7 g/L（pH5.8-6.0）; (2)Adventitious buds induction culture media：MS + NAA 0.05 mg/L +6-BA 1.0 mg/L + Putrescine 500mol/L + Spermidine 100mol/L + Vc 100mg/L

6、+ Socrose 30g /L + Agar 7 g/L（pH5.8- 6.0）; (3)Adventitious buds elongation culture media：1/2MS+ NAA 0.05 mg/L + LC 0.8 mg/L + Vc 100 mg/L + Socrose 30 g /L + Agar 7 g/L（pH5.8-6.0）; (4)Rooting culture media：1/2MS + IBA 0.5 mg/L + Vc 100 mg/L+ Socrose 30 g/L + Agar 7 g）.Key words:Eucalyptus grandis &#

7、215;Eucalyptus urophylla; Regeneration system; Tissue culture桉树(Eucalyptus) ,桃金娘科(Myrtle family)，桉属（Eucalyptus）,原产澳大利亚的高大乔木。桉树以其生长快、适应性强、材质好、用途广而被世界上百余个国家和地区广泛引种栽培 ,是目前世界上最重要的木纸浆原材料之一。桉树引种我国已有一百多年的历史 ,是我国南方热带、亚热带地区最重要的速生丰产林造林树种之一, 广泛栽培于广东、广西、福建、云南和海南等省区1。桉属树种是异花授粉的多年生木本植物，杂种后代严重分离变异，用有性繁殖方法很难保持优良树种的

8、特性，采用激素虽能解决其扦插，压条、驳枝等繁殖方法的生根问题，但大量繁殖仍有一定困难2。为此，国内外均已开展桉树组织研究，其中大约已有30种桉树从其各种器官组织诱导出愈伤组织，然而，桉树作为含酚类丰富的木本植物，从愈伤组织获得再生植株有相当大的难度，目前成功获得再生植株的只有10多个种3。建立桉树组织培养与再生系统 ,既可为商品化大规模育苗做准备 ,又有助于建立遗传转化体系 ,为利用转基因手段进行桉树的遗传改良奠定良好的基础。随着桉树产业化不断推进和对优良速生、抗病的无性系品种的需求，基因工程育种必将成为桉树组织培养研究的主要发展方向4-5。可基因工程育种是一项综合性工作，它的重要前提就是必须

9、建立桉树高效稳定离体再生体系，因此探究如何经过愈伤组织诱导建立桉树稳定再生系统是相当重要的6-7。尾巨桉（Eucalyptusgrandis ×Eucalyptusurophylla )是尾叶桉(Eucalyptusurophylla )和巨桉（Eucalyptusgrandis）杂交的速生树种，具有生长快、用途广、经济效益好的特点，从而得以在华南地区广泛引种， 并迅速成为南方商品林基地建设的主要树种8-10。本文以尾巨桉无性系无菌苗的茎段为外植体，对尾巨桉无性系再生体系的建立进行了研究，为尾巨桉商品化快繁育苗及转基因研究奠定基础。1 材料与试剂1.1 材料供试材料为湛江林业科学研究

10、所提供的尾巨桉DH32-29无性系无菌苗1.2 试剂 主要植物生长调节剂的配制LC（1.0 mg/mL）：先溶于少量二甲基甲酰胺，再加水定容。IAA 、NAA（0.5 mg/mL）：先溶于少量95酒精，再加水定容。2,4-D（0.1 mg/mL）：先溶于少量95酒精，再加水定容。IBA（1.0 mg/mL）：先溶于少量95酒精，再加水定容。6-BA（0.5 mg/mL）：先溶于少量NaOH溶液，再加水定容。Spd（100mmol/L）：称取亚精胺1.275 g溶于水，定容至50mL。Put（500mmol/L）：称取腐胺2.205 g溶于水，定容至50mL。TDZ（100 mmol/L）：称取

11、1.101gTDZ溶于少量95酒精，用水定溶至50mL。 培养基基本成分的配制方法(见表1)表1 MS培养基的基本成分（单位mg/L）培养基MS大量元素NH4NO31650KNO31900CaCl2·2H2O440MgSO4·7H2O370KH2PO4170微量元素H3BO36.2CoCl2·6H2O0.025CuSO4·5H2O0.025MnSO4·4H2O22.3KI0.83Na2MoO4·2H2O0.25ZnSO4·7H2O8.6铁盐Na2·EDTA·2H2O37.3FeSO4·7H2O2

12、7.8有机物肌醇100烟酸0.5VB10.5VB60.1甘氨酸2注：1/2MS培养基的配置是大量元素为MS的一半，其它不变。2 实验方法2.1不同激素组合对愈伤组织形成的影响选取幼嫩粗壮的尾巨桉无菌苗，将茎段切成0.40.7cm长的小段，并接种于愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基以MS作为基本培养基，附Vc100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，添加不同浓度梯度的6-BA和2,4-D与LC和IAA组合，培养条件为：温度25±2，暗培养。14天后统计愈伤组织诱导率（愈伤外植体数占总外植体数的百分比）。2.2 不定芽的诱导2.2.1不同激素组合对不定芽诱导的影响将培养了14天

13、的长势良好的愈伤组织接种于不定芽诱导培养基上，不定芽诱导培养基以MS作为基本培养基，附Vc100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，腐胺500mol/L，亚精胺100mol/L，添加不同浓度梯度的6-BA和NAA与LC、IBA和TDZ组合。培养条件为：温度25±2，光照12h·d-1，光照强度20002500lx。10d左右更换新鲜培养基，定期观察和记录不定芽诱导情况，40 d后统计诱芽率（出芽的外植体数占外植体总数的百分率）。2.2.2愈伤组织诱导时间对不定芽诱导的影响将分别诱导了8d，10d，12d，14d，16d，18d的愈伤组织，接种于添加6-BA和NAA的不定

14、芽诱导培养基上。培养条件为：温度25±2，光照12h·d-1，光照强度20002500lx。10d左右更换新鲜培养基，定期观察和记录不定芽诱导情况，40d后统计诱芽率（出芽的外植体数占外植体总数的百分率）。2.3不同浓度激素对不定芽伸长的影响将芽丛切割成单株，转移到不定芽伸长培养基中，基本培养基为1/2MS，附加Vc 100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，以及不同浓度梯度的LC与NAA组合，培养条件为：温度25±2，光照12h·d-1，光照强度20002500lx。10d左右更换新鲜培养基，20d后观察不定芽伸长情况。2.4不同浓度激素对生根的影

15、响将高2.5cm左右的无菌苗转入生根培养基上，基本培养基为1/2MS，附加Vc 100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，以及不同浓度梯度的IBA，培养条件为：温度25±2，光照12h·d-1，光照强度20002500lx。20d后统计生根率（生根苗数占总苗数的百分比）。3 结果与分析3.1 不同激素组合对愈伤组织形成的影响茎段接种68d后陆续开始产生愈伤组织。愈伤先从下胚轴两端切口处长出，使下胚轴呈哑铃状，以后逐渐从两端延伸形成膨大的愈伤组织。愈伤组织有白色，黄绿色，暗红色，绿色，其中大部分白色愈伤组织体积膨大，结构疏松，而黄绿色，绿色，暗红色愈伤组织结构致密，呈颗粒

16、状，不过暗红色愈伤组织易于老化，之后很少观察到芽的分化，分化为芽的愈伤组织为黄绿色，绿色的愈伤组织。2,4-D与6-BA及IAA与LC组合均能诱导产生愈伤组织。表2 不同激素组合启动愈伤组织形成情况2,4-D (mg/L)6-BA (mg/L)IAA(mg/L)LC(mg/L)诱导率(%)愈伤组织生长状况0.10.20072.2生长慢，白色，质地松散0.20.20054.3生长慢，白色，质地松散0.30.20036.9生长较慢，暗红色，质地紧密0.10.40083.4生长快，暗红色，质地紧密0.20.40081.6生长快，白色，质地松散0.30.40062.8生长快，黄绿色，质地紧密0.10.

17、60092.7生长快，黄绿色，质地紧密0.20.60088.5生长快，暗红色，质地紧密0.30.60063.2生长慢，黄绿色，质地紧密000.03185.3生长慢，白色，质地松散000.05188.4生长较慢，白色，质地松散000.10191.8生长快，黄绿色，质地紧密000.03294.6生长快，黄绿色，质地紧密000.05296.4生长快，黄绿色，质地紧密000.10289.1生长快，黄绿色，质地紧密000.03393.7生长快，暗红色，质地松散000.05381.2生长快，暗红色，质地紧密000.10350.6生长慢，暗红色，质地紧密基本培养基一致的情况下，不同激素组合对愈伤组织形成有显

18、著影响，不同浓度的2,4-D与6-BA的组合诱导率从36.9%到92.7%不等。低浓度的2,4-D更有利于愈伤组织的产生，随着2,4-D质量浓度的提高，愈伤诱导率却呈现出下降的趋势；随着6-BA浓度的增加，诱导率呈上升趋势，说明6-BA有利于尾巨桉愈伤组织的诱导。当6-BA浓度为0.6mg/L，2,4-D浓度为0.1mg/L时，诱导率达92.7%，愈伤组织呈淡绿色，活性强，为该激素组合中诱导尾巨桉愈伤组织的最适浓度。不同浓度的IAA与LC组合对愈伤组织的诱导影响也较大，诱导率从50.6%到96.4%不等，低浓度LC诱导形成的愈伤组织大多呈白色，结构松散，并随着IAA浓度的提高，诱导率也相应提高

19、；高浓度LC诱导形成的愈伤组织大多呈暗红色，结构紧密，并随着IAA浓度的提高，诱导率呈现出下降的趋势。当LC浓度为2 mg/L、IAA浓度为0.05 mg/L时，愈伤诱导率达到96.4%，愈伤组织呈黄绿色，结构紧密。具体试验结果见表2。3.2 不定芽的诱导3.2.1 不同激素组合对不定芽诱导的影响长势良好的愈伤组织接种后经过40d的培养，体积均有不同程度的增大，少部分愈伤组织由浅绿色、绿色转变为灰绿色或暗红色，并出现部分褐化现象。灰绿色愈伤组织表面干燥，质地较疏松，都未见芽点；暗红色愈伤组织表面较干燥，质地较紧密，部分可见12个黄绿或绿色小芽。绿色和黄绿色愈伤组织表面湿润，质地致密，大多数都能

20、分化出14个嫩绿色小芽，两周后，芽点有所伸长，分化出许多0.20.5cm高的小苗，统计数据见表3。表3 不同激素组合对不定芽诱导的影响NAA(mg/L)6-BA(mg/L)TDZ(mol/L)IBA(mg/L)LC(mg/L)接种数(个)出芽数(个)诱芽率(%)0.020.25000652944.60.020.5000654265.60.021.0000654975.40.050.25000653452.30.050.5000654873.80.051.0000655990.80.10.25000653553.80.10.5000655076.90.11.0000655584.60030.10

21、.5652741.50030.10.8653858.50030.11.0654366.20030.20.5654569.20030.20.8654772.30030.21.0654061.40030.30.5654467.70030.30.8653858.50030.31.0653046.2不同激素浓度对芽的诱导有较大的影响，在6-BA和NAA的组合中，各浓度梯度对不定芽的诱导差异很大，从44.6%到90.8%不等。当NAA浓度一定时，诱芽率随6-BA浓度升高而升高。当6-BA为1.0 mg/L、NAA为0.05 mg/L时，诱芽率达到最大，为90.8 %。在TDZ、IBA和LC的组合中，各浓

22、度梯度对不定芽的诱导差异也很大，IBA为0.2 mg/L时不定芽诱导率相对较高。当TDZ 为3mol/L、IBA 为0.2 mg/L、 LC 为0.8 mg/L 时诱芽率最大，为72.3%。3.2.2 愈伤组织诱导时间对不定芽诱导的影响将分别诱导8d，10d，12d，14d，16d，18d的愈伤组织，接种于不定芽诱导培养基上，40d后统计诱芽率，结果见图1。图1愈伤组织诱导时间对不定芽诱导的影响由图可见，当愈伤组织诱导时间为8天时，不定芽诱导率只有22.3%，随着愈伤组织诱导时间的增加，不定芽诱导率呈先上升后下降的趋势，愈伤组织诱导时间为14d时，不定芽诱导率达最大，为88.9%。3.3 不同

23、激素浓度对不定芽伸长的影响不定芽的伸长是无菌苗生根前的重要组织培养程序，伸长后的不定芽生理功能更加成熟，生命力更强，在生根后的移栽过程中能够更快的适应培养条件的变化。本试验设计了不同浓度激素组合来摸索不定芽伸长的适宜培养条件，实验结果见表4。本实验设计的所有激素水平均能使短小芽苗伸长，平均芽高的差异很大，从1.63.8cm不等。总的看来，NAA浓度为0.05 mg/L时芽伸长情况比0.02mg/L和0.08mg/L时好，而在NAA浓度一定的情况下，LC为0.8 mg/L时，芽苗生长情况较好。当6-BA浓度为0.05mg/L，LC浓度为0.8mg/L时，芽平均高达到3.8cm，茎粗壮，叶片呈绿色

24、，芽苗生长情况良好。表4不同激素浓度对不定芽伸长的影响NAA(mg/L)LC(mg/L)平均芽高（cm）生长状态芽的形态特征0.020.51.8+茎细弱，叶绿色0.020.82.5+茎较粗，叶绿色0.021.01.6+茎细弱，叶绿色0.050.53.5+茎粗壮，叶绿色0.050.83.8+茎粗壮，叶绿色0.051.03.2+茎较粗，叶绿色0.080.52.8+茎细弱，叶绿色0.080.83.1+茎较粗，叶绿色0.081.02.6+茎较粗，叶绿色注：+表示差，+表示一般，+表示良好3.4不同激素浓度对生根的影响试管苗的生根质量是组织培养成败的关键环节之一，包括分化出的根系类型、粗细、长短及健壮程

25、度等。降低无机盐的浓度有利于生根，但时间一长，营养太少不够吸收，所以选择1/2MS基本培养基较好。表5不同激素浓度诱导生根的情况IBA(mg/L)生根率(%)生根状况0.25789d后生根，根粗壮，须根多0.50949d后生根，根粗壮，须根多0.75929d后生根，根粗壮，须根较多1.009010 d后生根，根粗壮，须根较多1.258512 d后生根，根粗壮，须根少1.508012 d后生根，根粗壮，须根很少将2.5cm左右高的芽苗转入生根培养基，7d后在茎基部开始膨大，并有白色根点突起，912d之后陆续长根，根由茎直接发出，无愈伤组织形成。研究结果见表5，生根率从78%到94%不等。IBA浓

26、度升高，生根率反而降低。当IBA浓度为0.50 mg/L时，生根率最高，芽苗生根较多，根粗壮，平均根长最长，根系发达。4 讨论4.1桉树组织培养的复杂性木本植物为多年生植物,其细胞返幼状态差,难以脱分化,也难于分化成芽,因此在组织培养中诱导愈伤组织形成和分化均有较大难度,桉树也毫不例外。桉树组织培养是林木组织培养中研究较早较多的一大类，但组织培养成功的桉树种较少11，其原因可能是由于桉树不同种间甚至不同品种间存在不同程度的生理差异，这也导致桉树组织培养的复杂性。石大兴等12证实了这点，他们对28个巨桉优良无性系茎段进行组织培养，发现在相同的培养条件下不同的无性系间启动培养、丛生芽诱导培养、丛生

27、芽继代培养都存在较大的差异。在本实验中，曾参考尾巨桉其他品种、尾叶桉等能诱导出愈伤组织并成功获得再生植株的配方来对尾巨桉DH32-29进行愈伤组织的诱导和植株再生的试验，但均告失败，这显示了桉树组织培养技术的复杂性。因此，鉴于无性系本身所有的繁殖潜力不同，在桉树组织培养各个环节中，要不断地摸索和调整培养基的成分才能获得成功。4.2外植体的选取对尾叶桉再生的影响桉树选择合适的外值体诱导离体培养的重要性，已引起了更多的重视。原始外植体的幼态水平是能否成功建立桉树再生体系的重要因素。生长活力旺盛的幼嫩外植体能诱导出高活力的愈伤，易诱导出芽13-14。本实验以尾巨桉DH32-29无性系无菌苗的茎段为外

28、植体建立再生体系，幼嫩的茎段尚未木质化易诱导愈伤组织,表现为生长快,愈伤组织呈淡绿色、绿色或淡红色,生命力强，褐化比例低。切下的茎段0.30.7cm不等，较长的茎段（0.50.7cm）膨大较慢，一般先两端膨大，以后逐渐从两端延伸形成膨大的愈伤组织，易诱导出芽。切得较短的茎段（0.30.5cm）也能形成愈伤组织，但是难诱导出芽。4.3预防褐变的探究桉树愈伤组织褐化严重，褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。在切割外植体时,酚类化合物外溢,在外溢过程中与多酚类氧化酶接触,迅速氧化成褐色的醌类物质和水,醌类又会在酪氨酸酶等作用下,与外植体组织中的蛋白质发生聚合,进一步引起其他酶系统失活,从而导致组织代谢活动紊乱,生长停滞,最终衰老死亡15。在愈伤组织诱导时 ,温度和光照都会影响影响。过高的温度会造成一定的褐化现象。所以，培养时要严格控制组培室的温度。如出现褐化，应及时将褐化部分切除，并更换新的培养基，减小毒害作用 ,提高成活率。在本实验研究中，我们发现，选取生命活力旺盛的幼嫩材料作外植体、每次组培材料切割产生伤口后先进行暗培养、加入100mg/L的Vc，缩短培养基更新周期，都能预防褐变现象的产生。参考文献1白嘉雨等.桉树M.北京:经济管理出版社,2002，12(3)：26-28.2熊兆宽,许绪恩,区晓慧.桉树器官培养诱导