第十章高效液相ppt课件

1、第十章第十章高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法一、高效液相色谱仪一、高效液相色谱仪HPLCHPLC二、高效液相色谱法的特点二、高效液相色谱法的特点feature of HPLCfeature of HPLC三、流程及主要部件三、流程及主要部件general process and general process and main assembly of HPLCmain assembly of HPLC第一节第一节高效液相色谱的高效液相色谱的特点与仪器特点与仪器high performance liquid chromatographfeature and instrument of HPL

2、C第一节第一节 高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器 与经典液相色谱法比较与经典液相色谱法比较 与气相色谱法比较与气相色谱法比较 高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱吸附色谱(液固色谱液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色；离子交换色谱；尺寸排阻色谱谱(凝胶浸透色谱凝胶浸透色谱)。 早期液相色谱，包括早期液相色谱，包括Tswett的任务，都是在直的任务，都是在直径径15cm, 长长50500cm的玻璃柱中

3、进展的。为保证的玻璃柱中进展的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150200m范围内。即使这样，流速依然很低范围内。即使这样，流速依然很低(1mL/min)，分析时间依然很长！，分析时间依然很长！ 当加压添加流速当加压添加流速(真空或空气泵真空或空气泵)时，虽然分析时时，虽然分析时间减少，但柱塔板高度间减少，但柱塔板高度Hmin也相应添加了！或者说也相应添加了！或者说柱效下降了。为理处理分析时间及柱效问题，人们柱效下降了。为理处理分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地添加柱效的独一方法是减小填认识到：最为有效地添加柱效的独一方法是减小填

4、充物的粒径充物的粒径310 m ！ 直到直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及开展，才彻高效固定相以及高灵敏检测器的出现及开展，才彻底处理了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液底处理了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛运用。相色谱技术才真正得到广泛运用。1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：高速：HPLC采用高压输液设备，流速大添加，采用高压输液设备，流速大添加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，

5、完成一次分析需时数小时。加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规那么，固定相涂渍均高效：填充物颗粒极细且规那么，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因此柱效很高。可以在数分钟匀、传质阻力小，因此柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分别。内完成数百种物质的分别。高灵敏度：检测器灵敏度极高：高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧荧光检测器光检测器10-11g。色谱柱色谱柱: 柱长柱长/cm 10 25 10 200 柱内径柱内径/mm 2 10 10 50固定相粒度固定相粒度: 粒径粒径/ m 5 50 75 600 筛孔筛孔/目目 2500 300 200 30色谱柱入口压力

6、色谱柱入口压力/MPa 2 20 0.001 0.1色谱柱柱效色谱柱柱效/(实际塔板数实际塔板数/m) 2103 5 104 2 50进样量进样量/g 10-6 10-2 1 10分析时间分析时间/h 0.05 1.0 1 20高效液相色谱法高效液相色谱法经典液相经典液相(柱柱)色谱法色谱法工程工程高效液相色谱法与经典液相高效液相色谱法与经典液相(柱柱)色谱法的比较色谱法的比较2. HPLC与与GC的比较的比较分析对象及范围：分析对象及范围：GC分析只限于气体和低分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的物总数的20%；HPLC可以分析高

7、沸点、高可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的占有机物总数的80%。流动相的选择：流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的采用的流动相中为有限的几种几种“惰性气体，只起运载作用，对组分惰性气体，只起运载作用，对组分作用小；作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的时机多。它除了起液体的混合，可供选择的时机多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分别的对组分的作用产生竞争，即流动相对分别的奉献很大，可经过溶剂

8、来控制和改良分别。奉献很大，可经过溶剂来控制和改良分别。操作温度：操作温度：GC需高温；需高温；HPLC通常在室温下通常在室温下进展。进展。有机溶剂或一定有机溶剂或一定 pH 值的缓冲溶液值的缓冲溶液按分别过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较按分别过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱离子色谱离子色谱体积排阻色谱体积排阻色谱全多孔固全多孔固体吸附剂体吸附剂固定液固定液+载体载体高效微粒离高效微粒离子交换剂子交换剂不同孔径的不同孔径的多孔性凝胶多孔性凝胶固定相固定相流动相流动相分别原理分别原理平衡常数平衡常数不同极性不同极性有机溶剂有机溶剂不同极性有不同

9、极性有机溶剂和水机溶剂和水不同不同 pH 值值的缓冲溶液的缓冲溶液吸附系数吸附系数(KA)分配系数分配系数 (KP)选择性系选择性系数数 (KS)分布系数分布系数 (KD)吸附吸附 解吸解吸溶解溶解 挥发挥发可逆性的可逆性的离子交换离子交换多孔凝胶的多孔凝胶的浸透或过滤浸透或过滤方法方法工程工程第一节第一节 高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述 高效液相色谱的分类高效液相色谱的分类 高效液相色谱的运用范围和局限性高效液相色谱的运用范围和局限性运用范围运用范围 高沸点不易挥发，受热不稳定高沸点不易挥发，受热不稳定易分解，分子量大，不同极性的有机物，易分解，分子量大，不同极性的有机物，生物活性物质

10、及天然产物，化工产品及环生物活性物质及天然产物，化工产品及环境污染物等等。境污染物等等。方法局限性：方法局限性： 运用多种溶剂，本钱高，且易产生污运用多种溶剂，本钱高，且易产生污染，梯度洗脱比气相色谱的程序升温复杂染，梯度洗脱比气相色谱的程序升温复杂 短少通用的检测器短少通用的检测器 分析具有多种沸程的石油产品，不能分析具有多种沸程的石油产品，不能替代气相色谱法也不能替代中、低压液相替代气相色谱法也不能替代中、低压液相色谱法，尤其对受压易分解的生物活性样色谱法，尤其对受压易分解的生物活性样品品一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatogr

11、aph液相色谱仪液相色谱仪2液相色谱仪液相色谱仪3液相色谱仪液相色谱仪4二、高效液相色谱法的特点二、高效液相色谱法的特点 feature of HPLC feature of HPLC 特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分别分析方法。三、流程及主要部件三、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.1.流程流程2.主要部件主要部件(1) 高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而运用粒度很小的固定相为了获得高柱效而运用粒度很小的固定相 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇

12、丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)4. 4. 选择流动相时应留意的几个问题选择流动相时应留意的几个问题1尽量运用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声添加。2防止流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。3试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中堆积。4流动一样时还应满足检测器的要求。当运用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。第十章第十章液相色谱分析法液相色谱分析法一、影响分别的要素一、影响分别的要素factors

13、influenced factors influenced separationseparation二、分别类型的选择二、分别类型的选择choice of separation choice of separation typestypes三、液相色谱的运用三、液相色谱的运用application of HPLCapplication of HPLC四、液相制备色谱四、液相制备色谱preparative liquid preparative liquid chromatographychromatography第四节第四节影响分别的要素与操影响分别的要素与操作条件的选择作条件的选择high p

14、erformance liquid chromatograph factors influenced separation and choice of operation condition一、影响分别的要素一、影响分别的要素 factors influenced separation factors influenced separation1. 1. 影响分别的要素与提高柱效的途径影响分别的要素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中在高效液相色谱中, , 液体的分散系数液体的分散系数仅为气体的万分之一，那么速率方程中的分仅为气体的万分之一，那么速率方程中的分子分散项子分散项B/UB/U较小，可

15、以忽略不计，即：较小，可以忽略不计，即： H = A + C u H = A + C u 故液相色谱故液相色谱H-uH-u曲线与气相色谱的外形不曲线与气相色谱的外形不同，如下图。同，如下图。 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。故降低传质阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色谱中，不能够经过液相色谱中，不能够经过添加柱温来改善传质。恒温添加柱温来改善传质。恒温 改动淋洗液组成、极性是改动淋洗液组成、极性是改善分别的最直接的要素。改善分

16、别的最直接的要素。 2. 2.流速流速 流速大于流速大于0.5 cm/s时时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。降低流速，柱效提高不是很大。但在实践操作中，流量仍是一但在实践操作中，流量仍是一个调整分别度和出峰时间的重个调整分别度和出峰时间的重要可选择参数。要可选择参数。 3.固定相及分别柱固定相及分别柱 气相色谱中的固定液原那么上都可以用于液相色谱，气相色谱中的固定液原那么上都可以用于液相色谱，其选用原那么与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分其选用原那么与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分别柱的制备是一项技术要求非常高的任务，普通很少自

17、行别柱的制备是一项技术要求非常高的任务，普通很少自行制备。制备。二、分别类型选择二、分别类型选择 choice of separation types三、三、 HPLC的运用的运用 application of HPLC 1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm2.5mm(内径内径) 检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进展分析。2. 2. 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。稠

18、环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器四、制备型液相色谱四、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography 获得高纯物质色谱纯的有效方法。获得高纯物质色谱纯的有效方法。 半制备柱内径半制备柱内径8mm，长度，长度15 30cm，一次制备量，一次制备量.1mg；1.1.色谱柱的柱容量柱负荷色谱柱的柱容

19、量柱负荷 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响搜集物纯度时的最大进样对制备柱：不影响搜集物纯度时的最大进样量；量； 超载：进样量超越柱容量。柱效迅速下降，超载：进样量超越柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子量因子k k降低降低10%10%为宜。为宜。2. 2. 液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法搜集组分时，通常有以下情况： 1可获得良好分别，主峰 运用制备柱，超载提高效率； 2两主成分之间的小组分； 超载，分别切分使待分别组分成为主成分富集后，再次分别制

20、备。 3. 3. 制备型液相色谱制备型液相色谱 制备型液相色谱：构造与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分搜集器。 制备柱：内径2050mm，柱长50cm。习题习题 9. 用长用长15cm 的的ODS 柱分别二个组分，知在柱分别二个组分，知在实验条件下柱效实验条件下柱效n = 2.84 104m-1。用苯磺酸钠。用苯磺酸钠溶液测得死时间溶液测得死时间tM=1.31min，二个组分的保管，二个组分的保管时间分别为时间分别为tR1= 4.10min 及及 tR2= 4.38min 。1求求k1，k2， ，R。2假设添加柱长至假设添加柱长至30cm，分别度可否到达分别度可否到达1.5？解：解：68. 2134. 234. 210. 1110. 141084. 211410. 131. 110. 431. 138. 434. 231. 131. 138. 413. 231. 131. 110. 4422R21MMMR12kknRttkktttttkRR(2)知知80. 368. 21530cm30cm15?1112212122121RllRllRRllRR习题习题 10. 在某一柱上分别一样品，得以下数据。在某一柱上分别一样品，得以下数据。组分组分A、B 及非滞留组分及非滞留组