第04章 吸附层析

1、生物活性分子的分离与表征第3章、沉淀法第4章、吸附层析第5章、纸层析第6章、凝胶过滤层析第7章、离子交换层析第8章、亲和层析第9章、疏水层析第第4章章 吸附层析吸附层析Adsorption Chromatography4.1、层析法概述4.2、吸附层析4.3、薄层层析4.1、层析法概述层析法(色谱法、色层分析法、层离法）: 通过在固定相和流动相之间的物理和物理化学分配而将混合物中的两种或多种化合物相互分离的方法之总称。一、层析的概念 1901年，俄国植物学家茨维特将植物色素提取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在在柱中得到分离而形成不同颜色的谱带。混合色

2、素通过碳酸钙微粒被分离成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分离成不同色带的光谱现象一样。 1906年在一篇论文中将这种方法正式命名为色谱法，色谱法由此得名。二、层析的由来与发展1931年， R.Kuhn采用同样的方法从蛋黄中分离出黄体素、从玉米中分离出玉米黄色素。色谱法此时才开始为人们所重视。1941年，Martin成功地用具有亲水能力的硅胶介质填充的层析柱分离氨基酸。提出液一液分配层析最初的塔板论。20世纪50年代，Cermerr等发明了气相层析技术。20世纪60年代后，高效液相层析技术得到发展。 利用混合物中各组分的理化性质（如溶解度、吸附能力、电荷、分子量、分子极性、亲和力等）各不相

3、同，使各组分在支持物上移动速度不同而集中分布在不同的区域，借此将各组分分离。 层析不只是分离技术，也是一种分析方法。三、层析的原理所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶剂。 层析过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。四、层析的共同特点组分组分A组分组分B+ 流动相流动相固定相固定相吸附吸附溶解溶解结合等结合等解除上解除上述作用述作用反反复复进进行行组分组分A组分组分B移动速度不同移动速度不同五、层析的基本过程（一）

4、依操作形式分 分为柱层析、薄层层析和纸层析。六、层析法的分类（二）依流动相分 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。（三）依分离机理分（三）依分离机理分1.1.吸附层析吸附层析2.2.分配层析分配层析3.3.凝胶过滤凝胶过滤4.4.离子交换层析离子交换层析5.5.亲和层析亲和层析6.6.疏水层析疏水层析七、层析技术的应用范围无机化合物：无机盐类、无机酸类、络合物类等有机化合物：烷烃类、有机酸和有机胺类、杂环类等生物大分子：核酸和核昔酸类、蛋白质、酶及肤类、多糖及寡糖类、激素类等活体生物：病毒、细菌、细胞器等4.2、吸附层析（adsorption chromatography）吸

5、附层析是指混合物随着流动相通过由吸附剂组成的固定相时，主要由吸附剂对不同物质的不同吸附力而使混合物分离的方法。根据操作方法的不同，吸附层析又分为柱层析与薄层层析。一、吸附层析的基本原理在吸附柱层析中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂物质。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点，这些位点通过范德华力、氢键或静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合，其结合力的大小与各种生物大分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。混合物在层析柱中的分离过程，实质上是吸附、解吸附、再吸附的连续过程。二、吸附层析介质羟基磷灰石磷酸钙硅胶氧化铝硅藻土活性炭天然材料化学合成聚丙烯酞胺聚苯乙烯羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH2

6、，简称HA（hydroxyl apatite），极性吸附介质，吸附容量高，稳定性好（在T止丙醇丙酮乙酸甲醋乙酸乙酷乙醚氯仿二氯甲烷苯三氯乙烯四氯化碳炭硫化碳石油醚溶剂的酸碱性样品组分具有碱性，展层剂用适量乙二胺或浓氨水等调整pH为碱性。样品组分具有酸性，可以加入乙酸或甲酸等。薄层层析图谱展层方法将点样好的薄板浸入0.5-1.0 cm深的展层剂中，当展层剂的前缘移至薄板前缘约0.5 cm处，停止展层。将薄板迅速取出放平，用铅笔或小针记下溶剂的前缘位置，用吹风机的冷风吹干，然后显色，测其Rf值。4、显色和检测薄层展开后，无论对样品组分进行定量或定性分析，都需先确定它们在薄板上的位置。显色方法:物理

7、方法紫外灯照射化学方法茚三酮喷雾 碘蒸气熏5、Rf值的测定影响Rf值的因素1、溶剂和组分的性质2、支持介质的性质和质量3、支持介质的活度4、薄层的厚度5、层析槽的形状、大小和饱和度6、展层方式7、杂质的多少8、展层的距离9、样品量10、温度展层装置的大小依层析薄板的大小而定。溶剂的饱和度对分离效果影响较大，在不饱和展层装置中，展层易引起边缘效应，因为极性较弱和沸点较低的溶剂在边缘挥发得快，从而使组分在边缘的Rf值高于中部的Rf值。除了比较Rf值之外，不同展层剂展开后点的形状以及颜色也会有不同。6、定量分析1.洗脱测定法2.薄层扫描法薄层层析的优点:平板色谱简单、方便、操作费用低，可以在一块层析板上同时展开多个试样。采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开