总RNA的提取定量与RT-PCR

1、南方国升大学生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：级临床八年制组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称(TitleofExperimetn)总RNA的提取、定量与RT-PCR实验日期(DateofExperiment)1111 月 2727 日实验地点(LabNo.)第二实验室合作者(Partner)指导老师(Instructor)总分(TotalScore)教师签名(Signature)批改日期(Date)【预习报告】实验原理1)总 RNA 的提取与定量在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有 10-5科 gRNA,其中 rRNA 占总量的 80%-85%,tRNA 和核内小分子

2、 RNA 占 10-15%,而 mRNA 只占 1-5%。rRNA 由 28S、18S、5s 等几类组成，这些 RNA 分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA 分子种类繁多，分子量大小不均一， 在细胞中含量少， 绝大多数mRNA分子(除血红蛋白、 有些组蛋白mRNA以外)， 在3端存在20-250个多聚月 M 甘酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离 mRNA。RNA 分离的方法有：异硫鼠酸月瓜氯化葩超速离心法，盐酸月瓜-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶 K-细胞质 RNA 提取法等、异硫鼠酸月瓜-酚-氯仿一步法等。目前

3、常用的是 Trizol 法。Trizol 试剂适用于从细胞和组织中快速分离 RNA。TRIzol 的主要成分是异硫鼠酸月瓜和酚。异硫鼠酸月瓜属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 Trizol中还加入了 8羟基唾咻、3-疏基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA 选择性地进入无 DNA 和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收 RNA;用乙醇沉淀中间层可回收 DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。Trizol 试

4、剂可用于小量样品(50100mg 组织、5X106 细胞)也适用于大量样品(1g 组织、107细胞)。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总 RNA 无蛋白质和 DNA 污染，可用于 Northernblot,dotblot,ployA 筛选，体外翻译，RNase 保护分析和分子克隆。在用于 RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无 RNase 的 DNaseI 处理 RNA 样品，避免出现假阳性。共纯化的 DNA 可用作标准，比较不同样品 RNA 的得率，也可用于 PCR 和酶切。蛋白质可用于 westernblotting。2)逆转录-

5、聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)提取组织或细胞中的总 RNA,以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNAo 再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成 cDNA 探针、构建 RNA 高效转录系统。二、实验材料1）总RNA的提取1 .紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄 PCR 反应管

6、2 .Trizol 试剂 3.氯仿 4.异丙醇 5.75%乙醇6 .无 RNase 的水或 0.5%SDS（溶液均需用 DEPC 处理过的水配制）2）RT-PCR1. 基因扩增仪（如 PEGeneAmpPCRSystem2400 或 9700）、微量加样枪、凝胶成像系统、灭菌超薄 PCR 反应管2. RNA 提取试剂3. 第一链 cDNA 合成试剂盒4. dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mmol/L5. TaqDNA 聚合酶三、实验步骤（一）总 RNA 的提取1 .匀浆处理：a.组织将组织在液氮中磨碎，每 50-100mg 组织加入 1mlTrizol,用匀浆

7、仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol 体积 10%。b.单层培养细胞直接在培养板中加入 Trizol 裂解细胞，每 10cm2面积加 1ml,用移液器吸打几次。Trizol 的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol 加量不足可能导致提取的 RNA 有 DNA污染。c.细胞悬液离心收集细胞，每 5-10X106动物、植物、酵母细胞或 1X107细菌细胞加入 1mlTrizol,反复吸打。加 Trizol 之前不要洗涤细胞以免 mRNA 降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。（注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量 RNA 的前提；细胞数量与 Trizol 的比例，细胞的数量

8、不能过多。）2 .将匀浆样品在室温（15-30C）放置 5min,使核酸蛋白复合物完全分离。3 .可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于 2-8C10000Xg 离心 10min,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量 DNA,上清中含有 RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。4 .每使用 1mlTrizol 加入 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15s,室温放置 3min。5 注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。）5 .2-8C10000Xg 离心 15min。样品分为三层：底层为黄色（红

9、或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA 主要在水相中，水相体积约为所用 Trizol 试齐J的 60%。6.把水相转移到新管中（如要分离 DNA 和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的 RNA。每使用 1mlTrizol 加入 0.5ml 异丙醇，室温放置 10min。7 .2-8C10000g 离心 10min,离心前看不出 RNA 沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。8 .用 75%乙醇洗涤 RNA 沉淀。每使用 1mlTrizol 至少加 1ml75%乙醇。2-8C 不超过 7500g 离心 5min,弃上清。9.室温放置干燥或真空抽干 RNA 沉淀，不要晾得

10、过干，否则不易溶解，大约晾 5-10min。加入25-200 科无 RNase 的水，-70C 保存。(二)RT-PCR1.总 RNA 的提取：见前述内容。2.cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 TAKARA 公司提供的 PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit 试剂盒为例。(1)在 0.2ml 微量离心管中，加入以下：总 RNA1-5g、dNTP1 口、Randomprimer1 科 I、补充适量的 DEPCH2O 使总体积达 10 词轻轻混匀、离心。(2)PCR 仪上 65c 加热

11、 5min,立即将微量离心管插入冰浴中至少 1min。(3)然后加入下列试剂的混合物：5PrimeScriptbuffer4 平 RNaseinhibator0.5、RTase1plRNasefreeH2O4.5 臼 I轻轻混匀，离心.(4)30c 孵育 10min。(5)42c 孵育 60min。(6)于 70c 加热 15min 以终止反应，将管插入冰中。3. PCR:本次实验采用 PremixTaqVersion2.0(Loadingdyemix)试齐打(1)取 0.5mlPCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA2 口、上游引物(10pmoI/L)2 仆下游引物(10pmoI/L)

12、2 口、dNTP(2mmol/L)4 口、10XPCRbuffer5 怜 ITaq 酶(2U/6)1 口、(2)加入适量的 ddH2O,使总体积达 50 向轻轻混匀，离心。(3)设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参(如 G-3-PD)的特异性引物，同时扩增内参 DNA,作为对照。(4)电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。(5)结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。四、实验注意事项1、本实验大部分为 RNA 操作，注意 RNA 酶的污染。2、快速的操作，低温环境，少量取上清主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有 RNase 污染。3、加样原则是酶最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。【实验记录1 1一、实验条件见第一、第二部分。二、实验现象1、琼脂糖凝胶电泳图像:从凝胶电泳的图像上看，本组的反转录DN旅带可以看到与MARKER对应的特异性条带，但特异性不明显，也出现了弥散或非特异性条带。【结果与讨论】一、结果如上图所示。讨论(1)特异性反