流式细胞术的参考样品ppt课件

1、一一 参考规范样品在参考规范样品在FCM运用的意义运用的意义参考规范样品在参考规范样品在FCM中运用，为了监中运用，为了监测仪器的液流测仪器的液流电子和各个光学系统电子和各个光学系统的稳定性，校正和调试仪器的的稳定性，校正和调试仪器的CV值，值，最大限制的提高仪器的分辨才干最大限制的提高仪器的分辨才干 1.调整仪器在高性能的形状下任务。 2.由于FCM的丈量是相对的，而不是绝对的，所以参考细胞有助于单个样品或一组样品的丈量参数的解释。 3.参考规范细胞可供监测任务形状下仪器的稳定性，以使所测参数具有可靠性和可比性。 4参考细胞可被用于监测染色过程。 5可以用于校验FCM分选术的回收和纯度。参考

2、细胞的主要作用如下参考细胞的主要作用如下:二、二、 规范细胞样品具备的特性规范细胞样品具备的特性一个规范样品，应具有较恒定的体积一个规范样品，应具有较恒定的体积大小大小具有较恒定荧光发射量子具有较恒定荧光发射量子细胞的外形较一致细胞的外形较一致在液流中的流动取向较一致在液流中的流动取向较一致在悬液中可坚持高度的单分散形状，在悬液中可坚持高度的单分散形状，放置较长时间不会聚集、不改动其放置较长时间不会聚集、不改动其外形、体积大小及其光学特性外形、体积大小及其光学特性1. 外标法外标法规范样品在流式分析实验样品前或后，上规范样品在流式分析实验样品前或后，上仪器丈量，以校正仪器在任务条件下稳仪器丈量

3、，以校正仪器在任务条件下稳定性。定性。缺陷缺陷 由于参考样品与实验样品不同步染色，由于参考样品与实验样品不同步染色，以及在实验过程中仪器条件的漂移，能以及在实验过程中仪器条件的漂移，能够引起定量检测的误差，因此，近年在够引起定量检测的误差，因此，近年在流式细胞定量检测中已被摒弃。流式细胞定量检测中已被摒弃。参考规范的运用方法参考规范的运用方法2. 内标法内标法内标法是将规范样品与实验样品按一定的内标法是将规范样品与实验样品按一定的细胞数混悬在一同进展同步染色细胞数混悬在一同进展同步染色,这种方这种方法可以防止外标法引入的误差法可以防止外标法引入的误差,可以防止可以防止因染色、光源强度的瞬时动摇

4、，以及细因染色、光源强度的瞬时动摇，以及细胞流速的变化和流束与激光束焦点的漂胞流速的变化和流束与激光束焦点的漂移呵斥的实验结果偏向。移呵斥的实验结果偏向。内标法可保证规范样品与实验样品在同样内标法可保证规范样品与实验样品在同样条件下制备和丈量，可使丈量误差降到条件下制备和丈量，可使丈量误差降到最小限制。内标法在流式细胞丈量术中最小限制。内标法在流式细胞丈量术中已广泛运用。已广泛运用。三、参考样本的制备方法三、参考样本的制备方法非生物规范样本非生物规范样本 塑料微球已广泛运用于参考规范样塑料微球已广泛运用于参考规范样品，这些塑料小球可分为两种：品，这些塑料小球可分为两种：1. 无荧光塑料小球无荧

5、光塑料小球可用于散射光的校正，此种一致大小可用于散射光的校正，此种一致大小无荧光微球，对于校正仪器光散射无荧光微球，对于校正仪器光散射是非常有用的。最好采用是非常有用的。最好采用10m大小大小与正常人淋巴细胞大小类似，与正常人淋巴细胞大小类似，经过微球大小的丈量，可以对实验经过微球大小的丈量，可以对实验样品细胞的面积，直径，横截面积样品细胞的面积，直径，横截面积和体积作出相对大小的判别。和体积作出相对大小的判别。2. 标志有荧光染料的塑料微球标志有荧光染料的塑料微球标志荧光染料多项选择用标志荧光染料多项选择用PI、EB、FITC、AO等，等，荧光染色的塑料微球可用于调整和监测光散射荧光染色的塑

6、料微球可用于调整和监测光散射和荧光信号的检测。对不同荧光染色细胞所结和荧光信号的检测。对不同荧光染色细胞所结合的荧光的数目和细胞体积的大小进展较准确合的荧光的数目和细胞体积的大小进展较准确的计算。的计算。流式细胞仪对于微球分辨率的大小，取决于微球流式细胞仪对于微球分辨率的大小，取决于微球大小能否一致，分辨率的大小普通用变异系数大小能否一致，分辨率的大小普通用变异系数(Coeffience of Variation CV)来表示，目前有来表示，目前有的消费厂家出卖的商品微球已标明的消费厂家出卖的商品微球已标明cv值。值。美国消费微球有如下公司的产品：美国消费微球有如下公司的产品：1.DOW Di

7、agnostics 2.02m2.PolyscienCes Inc 400Valley Road Warrmgton PA 18979 1.75 m3.Becton Dickinson Conpany Production 1.75 m,2.02 m以上几种微球在以上几种微球在FACS仪器上，光散射仪器上，光散射CV值为值为1.2%，荧光，荧光CV值为值为2.2%(为浅黄色荧光为浅黄色荧光)。4.Duke Standard SamPLe 5.1 m5.Counter Electronics Inc 10 m这两种微球的这两种微球的CV值为光散射值为光散射2%，荧光，荧光2.8%。非生物性塑料小

8、球可作为长期运用于流式的规非生物性塑料小球可作为长期运用于流式的规范样品，其配制方法和保管方法根据出卖厂家范样品，其配制方法和保管方法根据出卖厂家的产品阐明。但各种微球多要避光保管，因白的产品阐明。但各种微球多要避光保管，因白炙光可使荧光微球的荧光淬灭。在冰箱内保管炙光可使荧光微球的荧光淬灭。在冰箱内保管要防止冷冻结冰和悬液枯燥破坏微球，在长期要防止冷冻结冰和悬液枯燥破坏微球，在长期运用过程中或换批号使要做对比鉴定。运用过程中或换批号使要做对比鉴定。 生物性规范样品1. 某些生物性颗粒 可作为短期规范，例如植物花粉、一些真菌等，可作为体积大小的光散射规范，但是由于其准确性较差，产生误差较大，且

9、在水中不易保管和易发生体积大小、光学型号特征等方面的变化，因此很少在流式细胞术中运用。鸡红细胞的制备：鸡红细胞的制备：鸡红细胞在体内为一终末细胞，其鸡红细胞在体内为一终末细胞，其DNA含量是均含量是均一致的，相当于正常人淋巴细胞一致的，相当于正常人淋巴细胞(二倍体细二倍体细胞胞)DNA含量的含量的35%，流式细胞术测定其，流式细胞术测定其DNA含量分布组方图。所得结果为单一狭窄、对称含量分布组方图。所得结果为单一狭窄、对称的正态峰，在前向光散射组方图上表现为两个的正态峰，在前向光散射组方图上表现为两个正态峰。出现两个光散射正态峰的缘由是鸡血正态峰。出现两个光散射正态峰的缘由是鸡血红细胞呈盘状，

10、在流过光探测敏感区时，由于红细胞呈盘状，在流过光探测敏感区时，由于细胞所处的取向不同，呵斥前向光散射强度不细胞所处的取向不同，呵斥前向光散射强度不同，因此在光散射组方图上出现不同大小的光同，因此在光散射组方图上出现不同大小的光散射信号，即呈两个正态分布的组方图。散射信号，即呈两个正态分布的组方图。生物细胞规范样品生物细胞规范样品鸡血红细胞即可作为鸡血红细胞即可作为DNA内参规范，也可以作内参规范，也可以作为调整仪器的规范样品，美国为调整仪器的规范样品，美国Stanford大学医大学医学部胜利的运用鸡血红细胞调试仪器，其学部胜利的运用鸡血红细胞调试仪器，其CV值最好可达值最好可达2%，用戊二醛固

11、定的鸡红细胞可，用戊二醛固定的鸡红细胞可发出自发荧光，在不染色的条件下，其激发光发出自发荧光，在不染色的条件下，其激发光谱和发射光谱与荧光素和罗丹明极接近，美国谱和发射光谱与荧光素和罗丹明极接近，美国Beckton Dickison消费的消费的FACS仪器上，其荧仪器上，其荧光分布的单峰光分布的单峰CV值在值在10%左右。左右。鸡血红细胞作为内参规范样品，放入实验样品鸡血红细胞作为内参规范样品，放入实验样品的比例为的比例为510:100。鸡血红细胞制备简单，。鸡血红细胞制备简单，来源丰富，价钱低廉，是一种值得提倡的内参来源丰富，价钱低廉，是一种值得提倡的内参规范。规范。 虹鳟鱼红细胞规范样品的

12、制备：虹鳟鱼红细胞规范样品的制备：鳟鱼血细胞的鳟鱼血细胞的DNA含量相当于人二倍体细胞含量相当于人二倍体细胞(人人淋巴细胞淋巴细胞)80%左右，由于其左右，由于其DNA含量接近于含量接近于人的二倍体细胞，其计算比值产生的误差较小，人的二倍体细胞，其计算比值产生的误差较小，鳟鱼红细胞鳟鱼红细胞DNA含量均一含量均一 .近年来，已有大量报道运用该细胞作为近年来，已有大量报道运用该细胞作为DNA定量定量检测的内参规范或仪器校正的规范样品，检测的内参规范或仪器校正的规范样品，Vindelov等运用鳟鱼和鸡血细胞作为双内参规等运用鳟鱼和鸡血细胞作为双内参规范，比较了鳟鱼细胞和鸡血细胞与二倍体细胞范，比较

13、了鳟鱼细胞和鸡血细胞与二倍体细胞DNA含量的计算比值，结果发现鳟鱼细胞与二含量的计算比值，结果发现鳟鱼细胞与二倍体细胞倍体细胞DNA比值误差较小。比值误差较小。 鸡血红细胞和鳟鱼红细胞DNA含量，随着其性别差别有所不同.表1 鸡、鳟鱼不同性别红细胞DNA含量 细胞类别 雄 雌 P值 鸡红细胞 100.0 96.3 0.001 鳟鱼细胞 100.0 100.6 0.023 人淋巴细胞悬液的制备：人淋巴细胞悬液的制备：正常人外周血中淋巴细胞是一终末细胞，具有细正常人外周血中淋巴细胞是一终末细胞，具有细胞核胞核DNA含量均一，细胞体积大小一致，形状含量均一，细胞体积大小一致，形状类似的特点，已作为适

14、用的调整流式细胞仪的类似的特点，已作为适用的调整流式细胞仪的生物性参考样品，并已被确以为一种可靠的二生物性参考样品，并已被确以为一种可靠的二倍体细胞倍体细胞DNA含量的参考规范，在肿瘤细胞含量的参考规范，在肿瘤细胞DNA倍体的研讨中，已广泛用于倍体的研讨中，已广泛用于DNA倍体的倍体的计算规范。计算规范。 元鱼血细胞的制备：元鱼血细胞的制备：元鱼血细胞的核元鱼血细胞的核DNA含量相当于人二倍体细胞的含量相当于人二倍体细胞的70%左右，其核左右，其核DNA含量均一，形状大小一致，含量均一，形状大小一致，国内已有作者采用元鱼细胞作为流式细胞仪的国内已有作者采用元鱼细胞作为流式细胞仪的参考目的，其变

15、异系数可达参考目的，其变异系数可达1.8%左右，远低于左右，远低于鸡血红细胞。其来源丰富，制备简单，一只元鸡血红细胞。其来源丰富，制备简单，一只元鱼可取鱼可取10ml血液，在血液，在80oC冰箱中保管两年冰箱中保管两年以上无任何变化，是实验中理想的生物性内参以上无任何变化，是实验中理想的生物性内参规范细胞。规范细胞。四、四、DNA定量分析参考规范定量分析参考规范 Tiersch等选择了等选择了39种脊椎动种脊椎动物细胞，运用流式细胞术定量分析物细胞，运用流式细胞术定量分析这些动物二倍体细胞的这些动物二倍体细胞的DNA含量含量(见见表表2)用于用于DNA含量分析的参考规范含量分析的参考规范细胞。

16、细胞。 标本采集标本采集:运用人末梢血淋巴细胞，牛、狗、运用人末梢血淋巴细胞，牛、狗、猪、鼠、马采用末梢血白细胞，其他动物均采猪、鼠、马采用末梢血白细胞，其他动物均采用全血细胞，用全血细胞，(这些动物的全血细胞均为有核这些动物的全血细胞均为有核红细胞红细胞)他们还提出他们还提出DNA含量的计算公式，含量的计算公式，DNA含量的单位以悄然克或沙克含量的单位以悄然克或沙克Pico gram. Pg 10-9/克来表示。克来表示。 PG7.0(X/S) (S/H) 7.0：二倍体淋巴细胞：二倍体淋巴细胞DNA含量值含量值 X：实验细胞组方图中：实验细胞组方图中G0/1期细胞峰的均道值期细胞峰的均道值

17、 H：人淋巴细胞：人淋巴细胞G0/1峰细胞均道值峰细胞均道值 S：内参考规范细胞：内参考规范细胞G0/1峰的均道值峰的均道值对于规范样品细胞对于规范样品细胞DNA含量的计算，不能运用染色体含量的计算，不能运用染色体条数计算条数计算DNA含量。含量。人类的二倍体细胞有人类的二倍体细胞有46条染色体条染色体(DNA含量为含量为7.0)，在，在东南亚有一种小鹿仅有东南亚有一种小鹿仅有6条染色体，但其二倍体细胞条染色体，但其二倍体细胞DNA含量与人二倍体细胞含量与人二倍体细胞DNA含量类似，家马的二倍含量类似，家马的二倍体细胞染色体为体细胞染色体为64条，但其二倍体条，但其二倍体DNA含量比人的二含量

18、比人的二倍体细胞还少约倍体细胞还少约10%。在运用规范样品的过程中，不同的染色和不同的固定在运用规范样品的过程中，不同的染色和不同的固定剂都会出现不同的定量分析结果，作者总结了一些文剂都会出现不同的定量分析结果，作者总结了一些文献报道和我们所测结果，人的淋巴细胞与鸡血红细胞，献报道和我们所测结果，人的淋巴细胞与鸡血红细胞，鳟鱼和元鱼红细胞鳟鱼和元鱼红细胞DNA含量的所测比值含量的所测比值(见表见表3)，还有，还有作者报道规范样品的保管温度和坚持时间也会对测定作者报道规范样品的保管温度和坚持时间也会对测定结果准确性产生影响，因此在运用规范样品时应严厉结果准确性产生影响，因此在运用规范样品时应严厉

19、遵照同样染色方法和固定方法。遵照同样染色方法和固定方法。五、肿瘤五、肿瘤DNA倍体规范倍体规范新颖组织细胞新颖组织细胞DNA倍体定量规范倍体定量规范1984年，在洛杉矶召开国际细胞分析年，在洛杉矶召开国际细胞分析学会学会,就就DNA含量分析的二倍体细胞含量分析的二倍体细胞规范作出了规定：在规范作出了规定：在DNA定量分析定量分析时，普通运用同种同一个体的正常时，普通运用同种同一个体的正常细胞细胞DNA含量作为二倍体细胞的规含量作为二倍体细胞的规范，禽、鱼类红细胞或荧光微球只范，禽、鱼类红细胞或荧光微球只能作为仪器准直的规范样品。能作为仪器准直的规范样品。因此，人的末梢血淋巴细胞被广泛用因此，人

20、的末梢血淋巴细胞被广泛用于于DNA二倍体规范样品细胞，在很二倍体规范样品细胞，在很多肿瘤细胞多肿瘤细胞DNA倍体倍体FCM研讨中，研讨中，也运用了人的淋巴细胞、白细胞和也运用了人的淋巴细胞、白细胞和单核细胞等。单核细胞等。1992年，由美国国立癌症研讨中心年，由美国国立癌症研讨中心,在亚特兰在亚特兰大组织召开了大组织召开了FCM DNA定量分析的一致规范定量分析的一致规范的国际会议，制定了的国际会议，制定了FCM DNA倍体的规范，倍体的规范，严厉运用严厉运用DNA二倍体规范样品，二倍体规范样品，DNA倍体的倍体的规范必需：规范必需：同种属，同个体，同样的正常细胞同种属，同个体，同样的正常细胞

21、同样的样品处置方法，同样的固定方法，同同样的样品处置方法，同样的固定方法，同样的染色方法，和样品细胞与样的染色方法，和样品细胞与DNA规范细胞同规范细胞同步染色，即采用内参考规范。步染色，即采用内参考规范。采用双内参规范即仪器准直规范细胞和采用双内参规范即仪器准直规范细胞和DNA二倍体细胞同时按一定细胞比例参与实验细胞二倍体细胞同时按一定细胞比例参与实验细胞样品中去。样品中去。石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的规范倍体分析的规范大量的实验研讨发现，石蜡包埋肿瘤组织大量的实验研讨发现，石蜡包埋肿瘤组织的的DNA定量分析中，其定量分析中，其DNA二倍体规范二倍体规范运用存在的差别比新

22、颖组织更大。运用存在的差别比新颖组织更大。Schutte等研讨发现，用新颖组织二倍体等研讨发现，用新颖组织二倍体细胞或用末梢血淋巴细胞以及用仪器准细胞或用末梢血淋巴细胞以及用仪器准直规范作为石蜡包埋肿瘤组织细胞直规范作为石蜡包埋肿瘤组织细胞DNA倍体规范更不适宜，主要缘由在于石蜡倍体规范更不适宜，主要缘由在于石蜡包埋组织的固定剂为包埋组织的固定剂为10%甲醛，如用甲醛，如用EB、PI等荧光染色，甲醛固定剂对细胞荧光等荧光染色，甲醛固定剂对细胞荧光染色有很强的干扰作用，而且在正常组染色有很强的干扰作用，而且在正常组织细胞之间也存在较大差别。织细胞之间也存在较大差别。我们对各种石蜡包埋的正常组织二

23、倍体细胞我们对各种石蜡包埋的正常组织二倍体细胞DNA含量进展了研讨，将人的淋巴细胞含量进展了研讨，将人的淋巴细胞DNA含量作为计算规范，将人的淋巴细胞分别出来含量作为计算规范，将人的淋巴细胞分别出来后，进展石蜡包埋，以后，进展石蜡包埋，以70%乙醇固定的鸡血红乙醇固定的鸡血红细胞作为细胞作为DNA内参规范，采用内参规范，采用PI同步染色，结同步染色，结果发现，各种正常组织细胞之间果发现，各种正常组织细胞之间DNA含量存在含量存在较大的差别较大的差别(见表见表4) 。各种正常组织细胞之间各种正常组织细胞之间DNA含量存在差别，推含量存在差别，推断，能够各组织细胞之间与荧光染料结合多少断，能够各组织细胞之间与荧光染料结合多少有亲密关系，荧光染料与有亲密关系，荧光染料与DNA结合取决于染色结合取决于染色质的构造和染色质的凝聚程度。质的构造和染色质的凝聚程度。例如例如7AAD(Aminoactionmycin，7氨基氨基放线菌素放线菌素D)与不同的正常组织与不同的正常组织DNA二倍体细二倍体细胞结合，可以测定不同的胞结合，可以测定不同的DNA含量结果。含量结果。例如精子细胞其染色质高度凝聚，像例如精子细胞其染色