生物化学实验教案

1、会计学1生物化学实验教案生物化学实验教案血糖管奥氏吸管7200型分光光度计 1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。4、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml. B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A液：

2、B液=15：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4）。 四、实验试剂1、无蛋白血滤液的制备：用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂草酸钠）1ml,缓缓放入50ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀。再加0.33mol/LH2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置515分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO412滴）。用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。五、实验步骤按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=OD1/OD2 C 10 100式中

3、:m=100ml全血中含血糖毫克数C=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）OD1=样品液光密度值OD2=标准液光密度值六、结果计算： 二、实验仪器1、新鲜肝脏2、100ml容量瓶3、7220分光光度计4、水浴锅5、试管(ml、2ml、5ml)试剂(ml) 空白管 标准管 测定管 肝糖原提取液 蒸馏水 标准葡萄糖液 0.2%蒽酮试剂 0 2.0 0 4.0 0 0 2.0 4.0 1.0 1.0 0 4.0 第一部分、蛋白质的颜色反应 0 1 2 3 4 5 6 2mg/ml 卵清蛋白液 （ml） 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 蒸馏水（ml） 3 2.7 2.4 2.1 1

4、.8 1.6 1.2 双缩脲试剂（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 OD540 0 实验八聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法分离牛血清蛋白序号ABCDEF1mol/L盐酸TrisTEMEDACrBis(NH4)2S2O3蔗糖加水并稀释至PH48ml36.6g0.23ml100ml8.948ml5.98g0.46ml100ml6.728g0.735g100ml10g2.5g100ml0.14g100ml40g100ml管号12备注0.5%酪素溶液2.02.037水浴中显色15分钟0. 2mol/L磷酸缓冲液1.002mg/ml胰酶溶液01.010%三氯乙酸溶液3.03.0过滤

5、上清液1137水浴中显色15分钟0.55mol/L碳酸钠溶液5.05.0福林试剂B11OD6800012345DNA标准液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20二苯胺试剂2.02.02.02.02.02.0加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。n淀粉在磷酸盐存在下经过磷酸化酶的作用，分解生成磷酸己糖，其第一个产物为葡糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate,简称G-1-P）。n保温后，将混合物加热煮沸，使蛋白质变性，破坏磷酸化酶以终止酶促反应。n实验原理1）马铃薯4预冷24小时2）

6、将100ml蒸馏水、两个500ml烧杯放入冰浴中冷却3）将马铃薯削皮，切成1cm见方的小块，放入冰浴中一烧杯内，满一烧杯为止。4）于绞肉机中搅碎，倒入烧杯内冰浴中冷却。5）向烧杯内加50ml蒸馏水，搅拌15min（不要太剧烈）6）将浆液用纱布过滤，滤液挤入冰浴中另一烧杯内，放置待用。1、磷酸化酶的制备滤液马铃薯组织匀浆器纱布过滤1）称取6g磷酸二氢钾、7.78g磷酸氢二钾，加70ml蒸馏水，煮沸。2）称取4g可溶性淀粉，加10ml蒸馏水，搅拌。3）剧烈搅拌下，将淀粉呈细流状加到上述磷酸盐溶液中。4）继续加热5min。此时溶液为米黄色透明，冰浴中冷却。6g磷酸二氢钾、7.78g磷酸氢二钾70ml

7、蒸馏水4g可溶性淀粉10ml蒸馏水酶液淀粉磷酸盐溶液1）酶液将与淀粉磷酸盐溶液混合，弃去泡沫，2）加少量甲苯，在溶液表面成一薄层。甲苯3）于33保温24h4）将保温液表层泡沫污物弃去，用碘碘化钾试剂进行碘反应检验，不显蓝色则进行以下操作。33保温24h1）采用分批煮沸的方法，使每次煮沸厚度为1cm左右将保温液煮沸。要在1min内完全沸腾，继续加热3min2）冰浴中快速冷却，1min内冷却至室温。3）将上清液用布氏漏斗抽滤，沉淀3000r/min离心5min后，再将上清过滤3000r/min离心5min冰浴4）滤液加2倍体积95乙醇，迅速搅拌，磷酸调pH至4.2（在冰浴中操作）。此时有白色磷酸盐

8、沉淀。5）半小时后，在布氏漏斗上通过两层滤纸抽滤。6）将滤液在低温下用饱和KOH溶液调pH至8.4，可得葡糖1磷酸二钾盐沉淀。静置24个小时滤液2倍体积95乙醇磷酸调pH至4.2饱和KOH溶液调pH至8.4静置24个小时7)过滤，即为粗产品饱和KOH溶液调pH至8.4静置5、产品的精制1）将抽干的粗产品用少量蒸馏水溶解，再加镁铵溶液10ml左右，至沉淀不再溶解。抽滤去除沉淀（主要为磷酸铵镁）。粗产品蒸馏水溶解镁铵溶液10ml2）向清液中加入2倍体积95乙醇，用10mol/L盐酸调pH至4，滤去沉淀（无机磷酸盐）。滤液2倍体积95乙醇10mol/L盐酸调pH至4.23）清液用饱和氢氧化钾溶液调至

9、pH值8.4，静置4）抽滤即得精产品，纯度不低于70。干燥磷标准（mL）00.51.02.03.04.05.0蒸馏水54.54.03.02.01.00定磷试剂3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml45恒温水浴25min25min25min25min25min25min25min660nm波长处测定吸光度7、葡糖1磷酸纯度检测1)称取7.44mg1G1P产品，溶于水，定容至10ml。2)取2只试管，各加0.2ml（有待实验进一步确定）产品溶液。3)管1加1ml2mol/L盐酸，100加热水解10min（有机磷全部溶解）。取出冷却，加12滴酚酞试剂，KOH调pH至红色4)管2以水代替盐酸，不加

10、热。5)另取一空白管3，不加样品管1管2管3盐酸水不加样品样品样品样品水100加热水解10min一、目的学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术二、原理核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及胞质中DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液（如1mol/L NaCl）在0.14mol/L 的盐溶液中溶解度降低而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L 盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖蛋白和核糖蛋白从样品中分别抽提出来脱氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开可用氯仿异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解

11、于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。1、称取肝脏8g，在冰浴中用研钵磨碎。2、加约20ml 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，3、4000r/min离心10min。4、沉淀再研磨一下，加25ml缓冲液，4000r/min离心20min。40ml 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠缓冲液20ml CHCl3-异戊醇混合液4ml 5 SDS摇床上振摇30minNaCl （约3.6g）3500r/min离心20min。取上清，加入等体积冷95乙醇8、提纯将上述所得的DNA粗品置于20ml 0.015mol/L NaCl

12、0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液中9、加入1倍体积的氯仿异戊醇混合液，振摇10min，离心（4000r/min，10min）。0.015mol/L NaCl0.0015 mol/L 柠檬酸三钠溶液氯仿异戊醇混合液4000r/min，10minDNA粗品10、倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5 倍体积95乙醇，DNA即沉淀析出。11、离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复一次。最后所得沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空干燥。95乙醇4000r/min，10min弃上清倾出上层液（沉淀弃去）粗DNA012345样品标准DNA溶液g/ml0.00.40.81.21.62.01蒸馏水/ml

13、2.01.61.20.80.401二苯胺试剂/ml4.04.04.04.04.04.04.0A595nm1、标准曲线的绘制 按下表加入各种试剂，混匀，于60恒温水浴保温45min2、冷却后，在595nm波长下，于722型分光光度计上比色测定，以吸广度对DNA浓度作图，制定标准曲线。DNA含量的测定三、实验试剂试剂01230.06mol/LNa4P2O2溶液（pH8.5）0.50.50.50.50.0015mol/LNAD溶液0.10.10.10.13mol/L甲醇溶液-0.1-3mol/L乙醇溶液-0.1-3mol/L正丙醇溶液-0.1蒸馏水2.32.22.22.2管号01234567标准磷溶液蒸馏水定磷试剂0330.12.930.22.830.32.730.42.630.52.530.62.430.72.33加毕摇匀，在45恒温水浴中保温10分钟，冷却，在660nm下测吸光度，以OD值为纵坐标，磷含量为横坐标作标准曲线。1）马铃薯4预冷24小时2）将100ml蒸馏水、两个500ml烧杯放入冰浴中冷却3）将马铃薯削皮，切成1cm见方的小块，放入冰浴中一烧杯内，满一烧杯为止。4）于绞肉机中搅碎，倒入烧杯内