生物化学合工大蛋白质化学2

1、会计学1生物化学合工大蛋白质化学生物化学合工大蛋白质化学2肽链的主链可看成是由被肽链的主链可看成是由被Ca a隔开的许多平面组成的。隔开的许多平面组成的。N端C端事实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只有一种或很事实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只有一种或很少几种构象，而且相当稳定。少几种构象，而且相当稳定。离子键离子键氢键氢键范德华力范德华力疏水相互作用力疏水相互作用力主要的化学键主要的化学键： 氢键氢键 1. a a-螺旋螺旋(a a-helix) 2. b b-折叠折叠 (b b-pleated sheet) 3. b b-转角转角 (b b-turn) 4. 无规卷曲无规卷曲

2、(nonregular coil)（二）二级结构单元的种类1 1）绝大多数天然蛋白质绝大多数天然蛋白质都是都是右手螺旋。右手螺旋。2）每隔）每隔3.6个氨基酸残基个氨基酸残基螺旋上升一圈；每圈间螺旋上升一圈；每圈间距距0.54nm，即每个氨基，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上酸残基沿螺旋中心轴上升升0.15nm，旋转，旋转100。-螺旋结构的主要特点：螺旋结构的主要特点：1.-1.-螺旋螺旋(-helix)(-helix)3 3）每个氨基酸残基的）每个氨基酸残基的N-HN-H都与前面（都与前面（C C端）端）第四个残基第四个残基C=OC=O形成形成氢氢键键。 4)4)螺旋体中所有氨基酸残螺旋体中

3、所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；链中基侧链都伸向外侧；链中的全部的全部C=OC=O和和N-HN-H几乎都平几乎都平行于螺旋轴行于螺旋轴, ,氢键几乎平行氢键几乎平行于中心轴于中心轴; ; * * R为为Gly时，由于时，由于Ca上有上有2个氢，使个氢，使Ca-C、Ca-N的转动的转动的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大大降低。大降低。R基大基大(如如Ile)也不易形成也不易形成-螺旋。螺旋。* * - -螺旋遇到螺旋遇到Pro就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸且有刚性的环状结构。氨基酸且有刚性的环状结构。

4、 * * 带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋的稳定性降低。的稳定性降低。侧链在侧链在a a-螺旋结构的影响：螺旋结构的影响：* * R R基较小基较小, ,且不带电荷的氨基酸利于且不带电荷的氨基酸利于-螺旋的形成螺旋的形成, ,如如多聚丙氨酸在多聚丙氨酸在pH7pH7的水溶液中自发卷曲成的水溶液中自发卷曲成-螺旋。螺旋。2.-2.-折叠折叠(-pleated sheet) -折叠折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结构。而成的锯齿状片状结构。在在b b- -折叠中，折叠中，a a-

5、 -碳原子总是处于折叠的角上，氨基碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的酸的R R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为酸之间的轴心距为0.350.35nm nm 。0.7nm b b-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。b b-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的折叠有两种类型。一种为平行式，即所

6、有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。后者更为稳定。链的方向相反。后者更为稳定。3.-转角（转角（-turn） 也称也称-回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折折180180，使得氨基酸残基的，使得氨基酸残基的C=OC=O与第四个残基的与第四个残基的N-HN-H形成形成氢键。第二个氨基酸通常是氢键。第二个氨基酸通常是propro。 -转角都在蛋白转角都在蛋白质分子的表面，多数质分子的表面，多数为亲水氨基酸组成。为亲水氨基酸组成。4.无规则卷曲（无规则卷曲（non-regular

7、coil） 又称自由卷曲，是指没有一定规律的松散肽又称自由卷曲，是指没有一定规律的松散肽链结构，但是其结构是明确而稳定的，常常构成链结构，但是其结构是明确而稳定的，常常构成酶的功能部位。酶的功能部位。 无规卷曲常出现在无规卷曲常出现在a-a-螺旋与螺旋与a-a-螺旋、螺旋、a-a-螺旋与螺旋与- -折叠、折叠、 - -折叠与折叠与- -折叠之间。折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的。它是形成蛋白质三级结构所必需的。（二）超二级结构的基本形式1 2 3 4 5 指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧形成三级结构的

8、局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域（密球状实体，称为结构域（domain）。）。 酵母己糖激酶的三级结构结构域之间有一段柔性的肽链结构域之间有一段柔性的肽链相连相连铰链区，使结构域之间铰链区，使结构域之间可以发生相对移动；结构域承可以发生相对移动；结构域承担一定的生物学功能，几个结担一定的生物学功能，几个结构域协同作用可体现出蛋白质构域协同作用可体现出蛋白质的总体功能；结构域间的裂缝的总体功能；结构域间的裂缝常为酶的活性部位，也是反应常为酶的活性部位，也是反应物的出入口。物的出入口。三、蛋白质的结构域三、蛋白质的结构域+结构域结构域乳酸脱氢酶结构域乳酸脱氢酶结构域1丙酮酸激酶结

9、构域丙酮酸激酶结构域43-P-甘油醛脱氢酶结构域甘油醛脱氢酶结构域2木瓜蛋白酶结构域木瓜蛋白酶结构域1木瓜蛋白酶结构域木瓜蛋白酶结构域2无规则卷曲无规则卷曲+ -螺旋结构域螺旋结构域无规则卷曲无规则卷曲+-回折结构域回折结构域 三级结构（三级结构（tertiary structure）：指的是：指的是多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成一步盘曲折叠形成球状分子结构球状分子结构。四、蛋白质的三级结构四、蛋白质的三级结构（一）三级结构的概念（一）三级结构的概念（二）球

10、状蛋白的三级的结构特征（二）球状蛋白的三级的结构特征含有多种二级结构单元。含有多种二级结构单元。分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋白质的活性中心。白质的活性中心。 大多数非极性侧链埋在分子内部，形成大多数非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核疏水核；而极性侧链在分子表面，形成而极性侧链在分子表面，形成亲水面亲水面。 蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。 分子呈现球状或椭圆状。分子呈现球状或椭圆状。（三）维持三级结构的作用力（三）维持三级结构的作用力二硫键二硫键 共价键共价键 疏水作用疏水作用非共价键（次级键）非共价键

11、（次级键）氢键氢键 离子键离子键范德华力范德华力 四级结构（四级结构（quaternary quaternary structurestructure）：由两条或两：由两条或两条以上具有三级结构的多肽条以上具有三级结构的多肽链聚合而成、有特定三维结链聚合而成、有特定三维结构的蛋白质构象。每条多肽构的蛋白质构象。每条多肽链又称为链又称为亚基亚基(subunit)(subunit) 。五、蛋白质的四级结构五、蛋白质的四级结构例如，例如，血红蛋血红蛋白的四白的四级结构级结构（一）四级结构的概念（一）四级结构的概念（二）蛋白质四级结构的特点v 1 1）有多个亚基）有多个亚基v 2 2）稳定性主要靠亚基

12、间的）稳定性主要靠亚基间的疏水作用疏水作用维持维持v 3 3）亚基单独存在时无生物活性或活性很小，）亚基单独存在时无生物活性或活性很小， 只有通过亚基相互聚合成四级结构后，蛋只有通过亚基相互聚合成四级结构后，蛋 白质才具有完整的生物活性。白质才具有完整的生物活性。 v 4 4）亚基见具有）亚基见具有协同性协同性和和别构效应别构效应。 二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构四级结构四级结构（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线O2血红素与氧结血红素与氧结合后，铁原子半径合

13、后，铁原子半径变小，就能进入卟变小，就能进入卟啉环的小孔中，继啉环的小孔中，继而引起肽链位置的而引起肽链位置的变动。变动。生理意义：波尔效应使血红蛋白运输生理意义：波尔效应使血红蛋白运输O2的效率提高。的效率提高。（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋：有些蛋白质错误折叠后相

14、互聚集，常形成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为Pr

15、Pc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病蛋白质的等离子点等离子点（特征常数）：指在纯水中（即没有其它盐类存在）蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。因蛋白质的等电点不是一成不变的，它随溶剂性质、离子强变等因素而改变。二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质 由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗的颗粒，因而具有胶体溶液的特征（粒，因而具有胶体溶液的特征（布郎运动、丁道尔现象、不布郎运动、丁道尔

16、现象、不能透过半透膜）。能透过半透膜）。1. 1.蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒表面形成高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒表面形成水化层，水化层，其可其可防止分子互碰而聚集防止分子互碰而聚集 ；蛋白质在非等电点状态时带同种电荷，在蛋白质在非等电点状态时带同种电荷，在颗粒表面形成颗粒表面形成电荷层，电荷层，同性电荷互斥，使分子不能聚集。同性电荷互斥，使分子不能聚集。+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋

17、白质在等电点的蛋白质水化层水化层+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用 蛋白质的聚沉蛋白质的聚沉蛋蛋白白质质胶胶体体溶溶液液沉沉淀淀作作用用示示意意图图 2.2.蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（失去水化层（消除相同电荷，除去水膜消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。液就不再稳定并将产生沉淀。 沉淀方法类别沉淀方法类

18、别: : 高浓度中性盐（盐析）高浓度中性盐（盐析） 等电点沉淀等电点沉淀 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 重金属盐类沉淀重金属盐类沉淀 生物碱试剂和某些酸类沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀 加热变性沉淀加热变性沉淀* 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 （三）蛋白质的变性与复性（三）蛋白质的变性与复性蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构特

19、定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。变和生物活性的丧失。1. 1.蛋白质变性的概念蛋白质变性的概念2. 2.变性的本质变性的本质 破坏非共价键，不改变蛋白质的一级结构。破坏非共价键，不改变蛋白质的一级结构。 应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。制剂（如疫苗等）的必要条件。 可逆变性作用可逆变性作用 蛋白质复性蛋白质复性（尿素

20、、（尿素、-巯基乙醇）巯基乙醇）（去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇）巯基乙醇）非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性（四）蛋白质的分子大小（四）蛋白质的分子大小蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于6000，最高可达40000000（烟草花叶病毒）。目前常用的方法包括：扩散系数、沉降超离心、凝扩散系数、沉降超离心、凝胶过滤、渗透压、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。胶过滤、渗透压、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。转头转头转头腔转头腔沉降样品沉降样品驱动马达驱动马达真空真空冷冻冷冻s = v2x v =沉降速度（沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度离心机转子角速度

21、（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）一般程序：一般程序：1、从组织细胞中溶解放出蛋白质，并保持天然状态，、从组织细胞中溶解放出蛋白质，并保持天然状态，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌酶破壁、破膜，再用常用低温冰冻、化学试剂及溶菌酶破壁、破膜，再用溶剂提取。溶剂提取。 2、分离所需要蛋白质与其他蛋白质、分离所需要蛋白质与其他蛋白质 a 等电点沉淀等电点沉淀 b 盐析和有机溶剂分级分离盐析和有机溶剂分级分离 纯化：纯化：a 离子交换层析离子交换层析 b 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 c 亲和层亲和层 析析 d 电泳方法电泳方法 3、结晶提纯、结晶提纯

22、a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白 b 结晶的最佳条件：略过饱和溶液结晶的最佳条件：略过饱和溶液 各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。 防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。（一）（一） 根据分子大小不同的分离方法根据分子大小不同的分离方法 1. 透析和超过滤透析和超过滤 透析：根据的是蛋白质不能通过半透膜的性质，透析：根据的是蛋白质不能通过半透膜的性质，而而 水和无机盐等小分子自由通过，此方法只水和无机盐等小分子自由通过，此方法只能能 将蛋白质和小分子物质分开，不能将不同将蛋白质和小分

23、子物质分开，不能将不同蛋蛋 白质分开。白质分开。 超过滤：是利用外加压或离心使水和其他分通过半超过滤：是利用外加压或离心使水和其他分通过半 透膜，蛋白质留在膜上。透膜，蛋白质留在膜上。透析与超过滤简易装置透析与超过滤简易装置2. 密度梯度离心密度梯度离心a.蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小也取决于它的密度。b.颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前。c.在离心力的作用下，各种蛋白质在不同密度介质中形成独立的区带。（二）利用溶解度差别的分离方法（二）利用溶解度差别的分离方法1. 等电点沉淀等电点沉淀 利用各种蛋白质在等电点时，溶解度最利用各种蛋白质在等电点时，溶解度最小小 这一性质，可

24、以通过调节蛋白质溶液的这一性质，可以通过调节蛋白质溶液的PH 值值 ，将不同的蛋白质分开。，将不同的蛋白质分开。2. 盐溶和盐析盐溶和盐析盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层，使蛋白质溶解度增加；盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。分段盐析：不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同，蛋白质溶液中，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。3.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法a有机溶剂（与水相溶）争取蛋白质颗粒上的水膜，使之沉淀。b有机溶剂：乙醇、丙酮c低温操作，边加入边搅拌，防止局部过热，引起变性，尽量缩短处理时间。（三）根据电荷不同的分离方法（

25、三）根据电荷不同的分离方法 1 . 电泳电泳 原理与原理与AA的电泳相同的电泳相同 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同分子大小不同的的蛋白质所带蛋白质所带净电荷密度不同净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以，迁移率不同，在电泳时可以分开。分开。 a. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 b. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进 行电泳，不同组分形成带状区域。行电泳，不同组分形成带状区域。 1）纸电泳：用滤纸作支持物。）纸电泳：用滤纸作支

26、持物。 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作 支持物。支持物。 1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。）平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。+-+PAGE垂直平板电泳示意图垂直平板电泳示意图低低浓度浓度浓缩浓缩胶胶高高浓度浓度分离分离胶胶聚丙烯酰胺凝胶电泳具有三种物理效应：聚丙烯酰胺凝胶电泳具有三种物理效应： 浓缩效应浓缩效应 分子筛效应分子筛效应 电荷效应电荷效应等电聚焦电泳等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。净电荷为零，在电场中不再移动。+5.06.07.0稳定稳定pH梯度梯度5.06.07.0稳定稳定pH梯度梯度通电通电+离子交换层析法离子交换层析法 （四）（四） 蛋白质的选择吸附分离蛋白质的选择吸附分离1极性的硅胶和氧气铝以及非极性的活性碳等具有吸附能力2吸咐层析法是利用物质与不同蛋白质的吸附能力的强弱不同达到分离目的。3蛋白质提纯中，最广泛和最有效的是结晶磷酸钙即羟基磷灰石。（五）根据配体特异性的分离（五）根据配体特异性的分离亲和层析亲和层析1.是一种极