毛细管电泳与超临界流体色谱

1、第四部分第四部分 毛细管电泳毛细管电泳与超临界流体色谱与超临界流体色谱 第一章第一章 毛细管电泳毛细管电泳 第一节第一节 概述概述一、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配系数的不同而进行分离的一类新型液相分离技术。 二、毛细管电泳的发展史及新动向 瑞典科学家Tiselius在1937年首先提出电泳，创造了Tiselius电泳仪，并建立了移动界面电泳方法。1948年他获

2、得了诺贝尔化学奖。 1988年美国Bio-Rad公司研制出第一台毛细管电泳仪HPE-100型 。 1989年在Boston召开首届HPCE专题会议。 1981年，Jorgenson创立了毛细管电泳技术 。三、电泳与色谱1. 作用原理作用原理2. 分离过程分离过程3. 仪器构成仪器构成4. 分离通道的形状分离通道的形状四、毛细管电泳的特点 1. 高灵敏度 紫外检测器的检测限可达10- -1310- -15 mol，激光诱导检测器可达10- -1910- -21 mol； 三高二少一广三高二少一广 2. 高分离效能 每米理论塔板数可达几百万甚至几千万； 3. 高速度 通常的分析时间不超过30 mi

3、n。有1.7 min内分离19种阳离子及3 min内分离30种阴离子的报道； 4. 样品用量少 只需纳升级的进样量； 5. 分析成本低（消耗少） 只需少量（几毫升）流动相，分析过程是在价格低廉的毛细管柱中进行行； 6. 应用范围广 可分离小分子（氨基酸、药物等）、离子（无机及有机离子）、生物大分子（蛋白质等）、甚至各种颗粒（如细胞、硅胶颗粒等），具有“万能”分析功能或潜力。 五、毛细管电泳的分类 1. 毛细管区带电泳（CZE） 又称自由溶液毛细管电泳 2. 毛细管凝胶电泳（CGE） 属非自由溶液电泳，含有“分子筛”效应。 3. 毛细管等速电泳（CITP） 电泳型 4. 毛细管等电聚焦（CIEF

4、） 按等电点分离，属电泳型，要求完全抑制电渗流动。 5. 胶束电动毛细管色谱（MECC） 又称电动色谱（EKC），是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离新技术，为CZE扩展的色谱型。 6. 毛细管电色谱（CEC） 又称毛细管电动色谱，属非自由溶液色谱型。 7. 微乳液电动毛细管色谱（MEEKC） 为CZE扩展的色谱型 8. 非水毛细管电泳（NACE） 属自由溶液电泳型。 第二节 毛细管电泳理论一、电泳和电泳淌度 电泳电泳是带电粒子在直流电场作是带电粒子在直流电场作用下于一定介质（溶剂）中所发用下于一定介质（溶剂）中所发生的定向移动。生的定向移动。 在电场作用下，带电粒子定向迁移的速度（电泳速度）可

5、用下式表示： Euepep电泳速度淌度电场强度 电场强度是指单位距离的电压降（V/cm）。 淌度（mobility）是指溶质在单位电场下的迁移速度，即单位电场下的电泳速度。 在无限稀释溶液中（稀溶液数据外推）测得的淌度称为绝对淌度（absolute mobility） 。 绝对淌度是在无限稀释时单位电场强度下带电粒子的平均迁移速度，是该离子在一定溶液中的特征物理常数。 电场力： 根据流体力学知道，（球型）离子的流动阻力F Ff ：qEFE离子电荷溶剂粘度离子有效半径ErruFepf66 一定时间后，两种力的作用达到平衡，即FE = Ff，此时离子作匀速运动，电泳进入稳态。 qEErep6iep

6、rq326溶液的介电常数粒子的Zeta电势棒状粒子： 4iep 显然，分子半径小，电荷大的离子具有较大的电泳淌度，而分子半径大，电荷小的离子具有较小的电泳淌度。 有效淌度（effective mobility）是实际测出的离子淌度，可表示为：epiief样品分子中的第i级解离度活度系数 它与带电粒子的电荷、形状、大小、离解度、溶剂化作用，溶剂的介电常数、粘度、pH值和温度有关。 电泳分离的基础是建立在各分离组分有效淌度的差异上。 二、电渗 电渗流（electroosmotic flow，EOF），简称电渗，是指管内溶液在外力电场作用下整体向一个方向运动的现象。 HPCE通常采用的是石英毛细管柱

7、，一般情况下（pH3），硅醇基（SiOH）电离为硅氧基负离子（SiO- -），使管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合离子（一般为阳离子）被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加高电压时，双电层中的阳离子向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了毛细管中溶液整体向阴极移动，产生电渗流。 电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度os表示。 EEuososos 一般情况下，电渗流的速度是电泳速度的57倍。电渗速度电渗淌度管壁的Zeta电势三、表观淌度和权均淌度 在毛细管电泳中，同时存在电泳和电渗，若不考虑它们之间的相互作用，粒子在毛细管内的迁移速度应当是电泳速度和电渗速度的矢量和，即 ：Eu

8、uu)(efosefosapefosap表观迁移速度电渗速度电泳速度表观淌度 组分 表观淌度 表观迁移速度正离子中性分子负离子efososefos-efosuuosuefosuu-分离后出峰次序为：正离子中性分子负离子+- -+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - -

9、 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -图图 毛细管分离示意图毛细管分离示意图四、两相分配与权均淌度 如果特意在毛细管中引入另一相，称为 P 相，样品在电迁移过程中同时会发生相间分配，其迁移速度或淌度将发生变化，这样改变了的粒子迁移速度和淌度，称为加权平均速度和加权平均淌度，简称权均速度和权均淌度。 设相分配过程远快于电泳过程，则有： pppappkkkEu111容

10、量因子样品在P相中的分子数样品在溶剂相中的分子数P相的表观淌度sppnnk P相在电场中可静止，也可迁移，运动方向可正、可负。利用引入P相，可使中性组分产生不同的权均淌度，因而解决了中性组分在毛细管电泳中的分离问题。 （一）迁移时间tR五、分离效率与谱带展宽 带电粒子从进样口迁移至检测窗所用的时间，称为迁移时间。 VLLuLtddRap迁移时间毛细管的有效长度毛细管的总长度外加电压（二）柱效和塔板高度 25 . 0)(54. 5WtnRnLHd理论塔板数迁移时间半峰宽塔板高度毛细管的有效长度（三）谱带展宽 1. 流型 以电场力驱动产生的EOF，与HPLC 中靠外部泵压产生的液流不同。EOF的流

11、型属扁平流型或称“塞流”。扁平型的塞子流不会引起样品区带的增宽，是毛细管电泳高效的重要原因 。 HPLC的流型则是抛物线状的层流，它在壁上的速度为零，中心速度为平均速度的2倍。 Van Deemter方程： 空心毛细管柱，则用Golay方程式表示：CuB/uAHCuB/uH涡流扩散项分子扩散项传质阻力 由于在毛细管电泳中，无固定相和流动相两相，因此不存在传质项，而且速度流型又是扁平的，于是只有纵向扩散项：D/uB/uH2DELDu/Ln2/2dapd扩散系数 毛细管电泳特别适合分离生物大分子。 2. 自热 15003cEd管径是影响自热的一个重要因素。理论上：E=50kV/m，c=0.01mo

12、l/L，d140 m实际应用2575 m的毛细管 使用小内径、大外径的毛细管，适当降低外加电压、降低缓冲溶液的浓度以及对毛细管恒温等均可以减小温度梯度，提高柱效。3. 扩散与吸附（1 1）扩散 （2 2）吸附 组分与毛细管壁的相互作用主要为管壁对组分的吸附。 六、分离度 分离度是指将淌度相近的组分分开的能力。 4)(2121221RRRRttWWttR-迁移时间峰底宽度标准偏差分离度也可表示为柱效的函数： 不考虑电渗流时： )(4efefnR)(4uunR当考虑电渗流时： 2/1)(241osefdefDLVLR第三节 毛细管电泳仪器系统 毛细管电泳仪主要包括高压电源、进样系统、分离系统、检测

13、系统和数据处理系统。 1234655图图 毛细管电泳装置示意图毛细管电泳装置示意图1高压电源高压电源 2检测器检测器 3液冷温控毛细管液冷温控毛细管 4数据记录系统数据记录系统 5缓冲液槽缓冲液槽 6缓冲液缓冲液一、高压电源 常用的高压电源为能提供030 kV，电流为200300 A的连续可调的直流高压电源，为了获得迁移时间的高重现性，操作电压要稳定在0.1%范围内。 高压电源要能够切换极性，最好是双极性高压源。 必须注意高压的安全保护问题。 高压源有恒压、恒流或恒功率等方式。最常用的是恒压源。 二、进样系统 毛细管内径很小，进样量必须很少，一般进样长度为毛细管总长度的1%2%。进样体积为纳升

14、（nl）级。所以毛细管的进样采用无死体积的进样方法。 毛细管的进样是让毛细管直接与样品接触，然后由重力、电场力或其他动力来驱动样品流入管中，进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。 在毛细管电泳中常采用的进样方式为电迁移进样和流体动力学进样，除此还有扩散进样。 1. 电迁移进样apVSuQ ErcEScQcQosefosefVin)()(2000进样体积毛细管的横截面积进样时间进样量样品浓度 电动进样的控制参数是电场强度E和进样时间 。通过改变进样电压和进样时间可以控制进样量。其中E是进样动力，取值多在110 kV/60cm之间，仅为分离时操作电压的1/51/3。 是进样时间，取值通常

15、在110 s之间，有时可达1 min或更大。 电动进样对毛细管内的填充介质没有特别限制，可实现完全自动化，但在电迁移进样中存在一种歧视效应，即电泳淌度大的组分进样量大，电泳淌度小的组分进样量小或不进，会降低分析的准确度和可靠性。2. 流体动力学进样)(820PLSrcQin进样量样品浓度毛细管两端压力差毛细管长度溶液的黏度 显然， P和 是控制参数，其中 P 是进样动力，可以通过如下几种方式进行：（a）在进样端加气压（正压）；（b）在出口端抽真空（管尾抽吸，负压）；（c）利用虹吸作用，即所谓的重力进样。 P 的取值一般在3450 Pa（约3447 Pa）附近。 的取值通常在15 s之间，有时可

16、超过60 s。 在流体动力学进样中不存在像电迁移进样中的歧视效应。利用重力虹吸进样：HgP 显然，进样量也可由 H 控制。 H 的取值通常在520 cm之间，多数取10 cm，对应的 多在530 s间取值。缓冲溶液的密度重力加速度毛细管进、出口的液面落差 虹吸进样方式一般为没有压力进样功能的仪器系统所采纳。3. 扩散进样DScQin24000 扩散进样动力属不可控制参数，进样量仅由扩散时间控制。扩散进样时间在1060 s间，属普适性进样方法。 扩散系数三、分离系统 分离系统包括毛细管、毛细管恒温系统、电极和缓冲液池。 1. 毛细管 目前最常用的是厚壁，内径为2575 m，有效长度为3075 c

17、m的熔融石英毛细管柱。并定期清洗。 2. 毛细管恒温系统 毛细管温度的控温精度应达到0.1。目前商品仪器配备的恒温系统有高速气流恒温和液体恒温两种。 3. 电极和缓冲液池 在毛细管电泳系统中，正负铂电极、进样端缓冲液池、检测端缓冲液池和充满运行缓冲液的毛细管构成了一个导电回路。 缓冲溶液液面高度控制是保证毛细管电泳分离效率和迁移时间重现性的重要因素。 缓冲液要经常更新，这样有助于提高电泳分离的重现性。 （一）紫外检测四、检测系统 紫外吸收检测是目前毛细管电泳最常用的检测方法，用于检测有紫外吸收的物质。依检测方式的差异，紫外检测器可分为固定波长、可变波长、二极管阵列等类型 一般采用柱上检测方式，

18、也可实现柱后检测。质量检测限为10-13 10-16 mol，浓度检测限为10-5 10-8 mol/L，其特点为通用性好，二极管阵列可提供光谱信息。 紫外检测器由光源、光路系统、信号接收和处理系统构成。（二）荧光检测 一般采用柱上检测方式。质量检测限为10-1510-17 mol，浓度检测限为10-710-9 mol/L，灵敏度高，需衍生化。（三）激光诱导荧光检测 也可采用柱上和柱后两种检测方式。质量检测限为10-1810-20 mol，浓度检测限为10-1410-16 mol/L，灵敏度非常高，通常需样品衍生化。 毛细管电泳的电化学检测器有三个检测模式：安培法、电导法和电位法。 （四）电化学检测 安培法测量化合物在电极表面受到氧化或还原反应时，失去或得到电子，产生与分析物浓度成正比的电极电流。1. 安培检测 是一种高灵敏度的电化学检测法，质量检测限为10-1810-19 mol，浓度检测限为10-1010-11 mol/L，灵敏度高，只适用于电活性物质；需要特殊的电化学和毛细管柱改性。 电导法和电位法是测量两电极间由于离子化合物的迁移引起的电导率或电位变化。 2. 电导检测和电位检测 电导检测通用性好，质量检测限为10-1510-16 mol，浓度检测限为10-7