第八章非水介质中的酶催化

1、第八章第八章 非水介质中的非水介质中的 酶催化反应酶催化反应Fig. 3 The cellulase and PEGylated cellulase activity after pre-incubation with various concentrations of BmimCl. The temperature was 50 C (A) and 80 C (B) with samples taken at 2 h of The DM was 6.25% for Cell-ALD 5k and 87.3% for Cell-SPA 5k. Fig. 4 The Cell-ALD 5k, C

2、ell-ALD 10k and Cell-ALD 20k activity after pre-incubation with various concentrations of BmimCl. The pre-incubation temperature was 50 C with samples taken at 2 h of incubation. Fig. 7 Total amount of reducing sugars released from MCC20世纪初，乙醇、丙酮类有机溶剂中酶催化的尝试；1966，胰蛋白酶、辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力的报道；197

3、51983，微生物细胞、游离酶、固定化酶用于有机溶剂中合成酯和类固醇及甾醇的转化；1984，Klibanov，在仅含微量水的有机溶剂中成功酶促合成多种有机化合物,并证实了酶在100高温下能够在有机溶剂中保持稳定，且显示很高的活力。 酶酶 催化反应催化反应 应用应用 脂肪酶脂肪酶 肽合成肽合成 青霉素青霉素G G前体肽合成前体肽合成 酯合成酯合成 醇与有机酸合成酯类醇与有机酸合成酯类 转酯转酯 各种酯类生产各种酯类生产 聚合聚合 二酯的选择性聚合二酯的选择性聚合 酰基化酰基化 甘醇的酰基化甘醇的酰基化蛋白酶蛋白酶 肽合成肽合成 合成多肽合成多肽 酰基化酰基化 糖类酰基化糖类酰基化羟基化酶羟基化酶

4、 氧化氧化 甾体转化甾体转化过氧化物酶过氧化物酶 聚合聚合 酚类、胺类化合物的聚合酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化酶多酚氧化酶 氧化氧化 芳香化合物的羟基化芳香化合物的羟基化 胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶 氧化氧化 胆固醇测定胆固醇测定醇脱氢酶醇脱氢酶 酯化酯化 有机硅醇的酯化有机硅醇的酯化（1）不溶性化合物催化转化（2）酶的热稳定性大大提高（3）可催化水中不能进行的反应 （4）可控制反应专一性，（5）酶和产物易于回收。（6）可避免长期反应中微生物的污染；（7）减少或防止由水引起的副反应；在非水介质中酶催化反应新特征和优势在非水介质中酶催化反应新特征和优势有机溶剂有机溶剂超临界流体超临界流体气相气相

5、离子液体离子液体 离子液（ionicliquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类， 酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和选择性。第一节第一节 酶催化反应的非水介质体系酶催化反应的非水介质体系酶催化反应中常用的有机溶剂体系：1.水互溶有机溶剂单相体系水互溶有机溶剂单相体系由水和与水互溶的有机溶剂(10%-20%)组成的反应体系，酶、底物、产物均能溶解产该体系中。有机溶剂：二甲亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮和低级醇等。2.水水有机溶剂两相体系有机溶剂两相体系由水相和非极性有机溶剂相组成的分相反应体系，酶溶解于水相中，底物和产物溶解于有机相中。有机相

6、：一般为亲脂的溶剂，如烷烃、醚、酯和氯代烷烃等 。3. 水不互溶有机溶剂单相体系水不互溶有机溶剂单相体系（含微量水的有机溶剂体系）（含微量水的有机溶剂体系） 由水不互溶的有机溶剂取代所有的溶剂水（98），形成固相酶分散在有机溶剂中的单相体系。有机溶剂：烷烃类、醚、芳香族化合物、卤代烃等。 4. 反相胶束体系反相胶束体系反相胶束体系是表面活性剂与少量水存在的有机溶剂体系。表面活性剂疏水性基团与有机溶剂接触，亲水性头部形成极性内核，里面容纳了酶分子。酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。反相胶束体系的组成反相胶束体系的组成a.表面活性剂（10%）溴化十六烷基三甲基胺()、丁二酸二

7、辛酯磺酸钠()和吐温()、聚氧乙烯醚类表面活性剂及磷脂等b.有机溶剂（8090%）六碳以上的烷烃,部分芳香族化合物及卤代烷类.c.水：(百分之几)d.助表面活性剂超活性1）底物的增溶作用：反胶束体系对底物的浓缩作用使其在核心水团中的实际浓度将大大高于其在水溶液中的浓度。2)酶分子构象刚性增加：在水中，酶结构的波动(fluctuation)扰动了催化构象，表面活性剂壳层的刚性缓冲了这种波动。3）胶束中结构水的特殊性质。二、非水介质中的酶的形式二、非水介质中的酶的形式1酶粉酶粉 有机介质中几乎不溶解，呈聚集状态。须剧烈搅拌或超声波处理，使两颗粒变小并悬浮于介质中。 2. 化学修饰酶化学修饰酶 化学

8、修饰可使酶溶解于有机介质，且稳定性和活性提高。 3. 固定化酶固定化酶 对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。第二节第二节 非水介质中酶促反应的条件非水介质中酶促反应的条件一、必需水一、必需水1.必需水：紧附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水，亦称结合水或束缚水(boundwater)。 酶的活性由必需水决定，而与溶剂里的水含量无关。 参与酶分子构象的形成和维持；作为“润滑剂”赋予酶分子一定的“柔性”2. 酶的水合过程与活性酶的水合过程与活性 首先与酶分子表面带电基团结合达到00.07克克(水酶)，酶无活性；然后与表面的极性基团结合0.070.25克/克，酶显示活性；

9、 再凝聚到表面相互作用较弱的部位0.250.38克克，酶活力随含水量增加而增加；最后酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。酶活力降低。3.必需水含量问题必需水含量问题因酶分子本身，或溶剂系统不同而有所不同。溶剂疏水性越强，需水量则越少。如胰凝乳蛋白酶，在甲苯中，含水0.5%； 氯仿等系统中，含水1.0%。4水活度水活度w水活度：在一定的温度压力下，反应体系中的水蒸汽压与纯水的蒸汽压之比。反映酶结合水的多少的一个参数； 可以排除溶剂对最适含水量的影响，最佳水活度与溶剂的极性几乎无关。获得恒定水活度的方法：获得恒定水活度的方法： 用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂。向反应体系中直接加一种

10、水合盐5水活度缓冲体系水活度缓冲体系酶反应必须在恒定的水活度下进行。添加含结晶水的水合盐到有机溶剂中可作为水活度的缓冲剂。二、有机溶剂的选择二、有机溶剂的选择1溶剂溶剂lgP及其对结合水和酶的影响及其对结合水和酶的影响 lgP：描述有机溶剂极性大小的参数，P值是溶剂在正辛醇和水中的分配系数。lgP越大，溶剂的疏水性越强。l疏水溶剂夺取酶分子表面必需水的能力比亲水性溶剂小2.有机溶剂与反应的相容性有机溶剂与反应的相容性底物相溶溶剂必须对于该主反应是惰性3溶剂对底物和产物的影响溶剂对底物和产物的影响 如：脂肪酶催化月桂醇和丁基硬脂酸的酯化反应，在十二烷（lgP=6.6）的活力只达到苯（lgP=2）

11、中酶活力的57.5%。l亲水性底物应选择疏水性较强的溶剂，而疏水性底物应选择疏水性弱的溶剂更好。4.溶剂的溶剂的pH值值酶的“pH记忆”：将酶先溶解在少量最适pH值缓冲溶液中直接冻干或从最适pH值缓冲溶液中沉淀，转入微水有机溶剂中，仍可以保持酶的电离状态。pH缓冲对缓冲对体系体系采用高疏水性酸和它的钠盐组成缓冲对或高疏水性的碱与它的盐酸盐组成缓冲对来维持反应体系的pH值。常用有机酸有：苯基硼酸、对硝基苯酚、三苯基乙酸、对甲苯磺酸和二苯基次磷酸、乙酸等 第三节第三节 有机介质对酶性质的影响有机介质对酶性质的影响一、稳定性一、稳定性热稳定性提高。储存稳定性提高。某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性

12、某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性 酶 介质条件 热稳定性猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯水， pH7.0T1/2 26 hT1/2 2 min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2 =1.5 hT1/2 2 min脂蛋白脂肪酶甲苯，90，400 h活力剩余40胰凝乳蛋白酶正辛烷，100水，pH 8.0, 55T1/2 = 80 minT1/2 = 15 min枯草杆菌蛋白酶正辛烷，110T1/2 = 80 min核糖核酸酶壬烷，110，6 h水，pH 8.0, 90活力剩余95T1/2 24 hT1/2 10 min限制性核酸内切酶 （Hind ）正庚烷，55，30d活力不降低-葡萄糖苷

13、酶2-丙醇，50，30 h活力剩余80溶菌酶环己烷，110水T1/2 =140 minT1/2 = 10 min本章目录稳定性增强的原因：稳定性增强的原因：（l）酶结构刚性增强；酶结构刚性增强；（2）水含量有限。水含量有限。在酶分子的不可逆变性过程中，水是一个必要的参予者。 二、活性二、活性 与水中相比，许多酶在有机溶剂中的催化活力降低。1扩散限制非均相催化，酶粉的凝集，导致酶与底物的接触受扩散限制的影响。2冷冻干燥的影响冻干失活，冷冻干燥过程会使酶二级结构发生较大变化添加多元醇和底物或底物类似物作为冷冻保护剂。3.底物解析能很多酶都具有疏水活性中心，当水被有机溶剂代替时，底物被解析到达活性中

14、心比在水中困难。4过渡态底物的稳定性很多酶的酶-底物反应过渡态是高极性的，并部分暴露在溶剂中，水比极性小的溶剂更能使中间体稳定。三、选择性介质工程（溶剂工程） ：通过改变反应介质来改变和控制酶催化反应的选择性。1底物专一性对于同一酶反应而言，不仅在水与有机溶剂中的底物专一性可能不同，而且在不同的有机溶剂中其专一性也不同。如：胰凝乳蛋白酶等蛋白水解酶在水溶液中催化疏水的苯丙氨酸和亲水的丝氨酸的N-乙酰氨基酸酯的水解反应速度，前者比后者快5104倍，而在正辛烷中催化转酯反应与水溶液中的结果相反。在20种不同溶剂中，枯草杆菌蛋白酶催化-乙酰-氨基酸乙酯与正丙醇之间的转酯反应，发现在不同的溶剂中,酶对苯丙氨酸酯和丝氨酸酯的反应专一性各不相同，最多相差68倍。底物专一性改变的原因是由于溶剂的改变导致底物在有机溶剂与酶的活性中心之间的分配系数发生了改变。2对映体选择性溶剂的影响。酶在不同介电常数的有机溶剂中，酶分子结构刚性程度不同，高介电性溶剂使酶的柔性增加时，酶的立体选择性降低。含水量的影响过高的含水量影响立体选择性l溶剂的几何形状也影响酶的对映体选择性。3前手性选择