流式细胞术描述

1、会计学1流式细胞术描述流式细胞术描述基本概念第一节 流式细胞仪基本结构与原理第二节 流式细胞术的数据分析第三节 流式细胞仪分析的技术要求第四节 流式细胞术的应用 一、流式细胞仪基本结构与功能 二、流式细胞术的重要术语 三、流式细胞术基本原理 四、流式细胞术的样本设置第一节 流式细胞仪基本结构与原理 将目的细胞群圈定（即设门），然后将门内细胞以FSC或SSC为横坐标，荧光信号为纵坐标的散点分布图表示出来，此图中细胞会出现在与其FSC或SSC相应的位置，并只可能表现两种情况：荧光信号弱或无、荧光信号强或有。 调节电压可改变目的细胞的荧光信号强弱，那么如何判断特异性荧光信号的有无？ 需要设置阴性对照

2、以确定细胞自身基础荧光域值，并通过它来判断待测样本中是否有特异性荧光信号。 首先通过调节电压将阴性对照细胞的基础荧光域值调至阴性致信区内，然后对阴性置信区进行界定，大于阴性置信区的荧光信号为特异性荧光信号。 对于流式样本来说，设置阴性对照是必须的，且阴性置信区一旦设定，将作为后续样本的阴、阳性判断的基础，不能随意变动。1. 分选速度：几千个细胞/秒2. 分选纯度: 99.5%左右 分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。3. 分选收获率: 90-95% 分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。前向散射光 (forward scatter)： FSC信号的强弱与细胞的大小相关侧向

3、散射光（side scatter)： SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关 利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。散射光的测定 利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”PMTPMTPMTPMT二分镜带通滤光片激光1234Flow cell 由若干组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成，它们分别将不同波长的光信号送入到不同的探测器。滤光片主要分为四类：长通滤光片（LP）、短通滤光片（SP）、带通滤光片（BP）和二分镜光学系统 以分布直方图( distribution histogram )来显示，横轴为该参数测量

4、强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。1.单参数直方图看图技巧：1.先看横、纵坐标，了解检测目的；2.看图形分布，直方图峰形越往右移，代表其荧光强度越强；3.M1的确定是根据阴性对照细胞的基础荧光域值设定的，峰形右移，荧光信号大于基础荧光域值（M1），表示阳性（M2）；4.数据统计时，检测目的物一般用各Marker区内的细胞所占百分比或用平均荧光强度表示；5.几个直方图的比较，关键看Marker（M1、M2）的位置以及细胞数。 能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横、纵坐标分别代表两个独立参数，平面上每一个点表示具有相应坐标值的

5、细胞。 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。3.二维等高线图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。4 .假三维图5.三维图 任意选三个参数为x，y，z轴，构成一个三维图，每一群细胞根据各自参数处于一个相对独立的空间，三维图对比较复杂的亚群的显示更为直观明了。 一、样品制备：单细胞悬液 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、质量控制第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求一、样品制备流式细胞仪的样品要求： 单细胞悬液，避免任何细胞沉积 被检细胞或颗粒大小0.240um 样品中至少20000个细胞，浓度105-106个/毫升（一）外周血淋

6、巴细胞样品的制备 利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散点图 单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。（二) 培养细胞的样品制备 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。 表面活性剂处理法： Triton-100、皂素等。(三)新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和

7、碎片的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。 防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。(四）单细胞悬液的保存 染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料荧光染料 激发波长（nm) 发射波长（nm) 颜色FITC 488 525 深蓝

8、色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。LaserCY5PECY5CY5488nm能量传递染料：荧光染料与细胞成分的结合方式： 结构亲和方式 嵌入结合方式 共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式1、直接免疫荧光染色2、间接免疫荧光染色（二）免疫荧光标记3、双或多参数荧光抗体的组合标记FIT

9、C+PE 488 525 、575 绿色、橙色FITC+T red 488 525 绿色 568 615 红色FITC+PeCy5 488 525、 675 绿色、 红色FITC+ ECD 488 525、 625 绿色、橙红色F+P +PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、红色F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 绿、 橙红色、红色F+P+APC 488 525 、 575 绿色、橙色 633 670 红色荧光染料 激发波长（nm) 发射波长（nm) 颜色（一）单细胞悬液制备的质量控制（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 1、温度对荧光染色的影响 2、pH对荧光发射强度的影响 3、荧光染料浓度的控制 4、固定剂对荧光染色的影响（三）仪器操作技术的质量控制三、质量控制 1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为同型对照（阴性对照） 2、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控，使得同类实验室建立质控比对，数据可