动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立

1、动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立秦启伟，黄晓红秦启伟，黄晓红有害生物控制与资源利用国家重点实验室有害生物控制与资源利用国家重点实验室中山大学生命科学学院中山大学生命科学学院2345细胞培养的材料准备细胞培养的材料准备1 细胞培养液2 胰酶消化液3 PBS缓冲洗涤液4 洁净无菌的细胞培养瓶、培养板67 培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品放置操作场所(培养室、超净台)内消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 培养室的消毒 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭

2、拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 洗手和着装 原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75酒精消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太

3、快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 89动物细胞原代培养过程图动物细胞原代培养过程图 取材 切割 消化接种培养10原代细胞的取材原代细胞的取材 11（3 3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（4 4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织

4、干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。量培养液的器皿中进行。（5 5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。尽量选用易培养的组织进行培养。（6 6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记对组织的来源、部位、

5、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。录，以备以后查询。12原代细胞的分离和制作原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自

6、血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方，最简单的方法是采用法是采用1000r/min的低速离心的低速离心10分钟，分钟，若悬液量大，可适当延长离心若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液

7、，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞样可根据需要收获目的细胞 13二、实体组织材料的分离方法 （一）机械分散法（一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中

8、压挤出。此压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理用于处理纤维成分少的软组织纤维成分少的软组织。14（二）消化分离法1、酶消化分离法、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：（）胰蛋白酶分散技术（）胰蛋白酶分散技术 胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰

9、蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、分散开胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。以及消化时间的长短等。细胞类型细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织, ,能有效地分离肝、肾、甲状腺、能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而

10、对含结缔组织较丰富的组织羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织, ,如如 乳腺、滑膜、子宫、纤乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效维肉瘤、肿瘤组织等就无效酶的浓度酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力活力1:200或或1:250)分离方法如下：分离方法如下：过夜冷消化过夜冷消化 将取得的组织用将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用毫米左右，用Hanks液洗液洗23次以除去血球和脂肪组织，再加入次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放的胰蛋白酶，摇匀后放4过夜

11、，次日再过夜，次日再用用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗液洗涤，弃去上清，共洗23次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。按适当的浓度分瓶培养。（）胶原酶（）胶原酶（Collagenase）消化法）消化法适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用可用适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或或0.10.3mg/mL。152、非酶消

12、化法（、非酶消化法（EDTA消化法）消化法）常用不含钙、镁离子的常用不含钙、镁离子的PBS配成配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好皮组织分散效果好 消化分离法的操作步骤：消化分离法的操作步骤：（1）剪切）剪切 把组织块剪碎，呈把组织块剪碎，呈15mm3大小的组织块。大小的组织块。（）加液漂洗（）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗洗2-3次（采次（采用倾斜，自然沉降法）。用倾斜，自然沉降法）。（3）消化）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）

13、于）于37水浴中作用适当时水浴中作用适当时间（中间可轻摇间（中间可轻摇12次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（4）弃去消化液）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（5）漂洗）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。次后，

14、加入完全培养基。（6）机械分散）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或34层无菌层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降510分钟，吸上层细胞悬分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。液进行分瓶培养。161、组织块培养法、组织块培养法(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。许培养基使组织湿润。(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm0

15、.5cm，一般在，一般在25mL培培养瓶养瓶(底面积为底面积为17.5cm2)可接种可接种2030小块为宜小块为宜,小块放置后小块放置后,轻轻翻转培养轻轻翻转培养瓶瓶,使瓶底朝上使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在将瓶倾斜放置在37温箱内。温箱内。(3)培养培养24小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清

16、、胎汁或鼠尾胶原等。失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养生长，培养35天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。小块所产生的毒性作用。原代细胞的培养方法原代细胞的培养方法 17182.消化培养法消化培养法该方法是采用

17、前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。193.悬浮细胞培养法悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。液分离后接种培养。20原代和传代细胞的培养

18、和维持原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持一、原代细胞的培养与维持 1、静置贴壁细胞、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗充分漂洗，以尽量除去消化液的，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5 5108108细胞细胞/L/L，培养基可用，培养基可用Eagle(MEM)Eagle(MEM)或或DNEMDNEM培养，小牛血清浓度为培养，小牛血清浓度为10%10%80%80%在起始的在起始的2 2天中天中尽量减少振尽量减少振荡荡

19、，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采此，需采取换液方式取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养

20、基。 212、悬浮细胞的培养、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞若要将淋巴细胞及白血病细胞进白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明变酸，说明细胞生长繁殖

21、良好，一般每隔细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。发生明显变化时，此时可考虑传代。悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式需求时，只能采用半量换液的方式 22二、原代细胞培养的首次传代二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。每进行一次分离再培养

22、称之为传一代，传至510代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至1020代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。在早先传代时，其消化时间比一般已建系的细胞相对长一些。(3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可

23、能减少对细胞的机械损伤。(4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和繁殖。如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失。(5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小牛血清浓度可适当加大至15%20%左右。 23三、传代细胞的传代培养三、传代细胞的传代培养(1)吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。培养瓶为例）。(2)每瓶加入每瓶加入2mL，无钙、镁，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉。，漂洗一次后倒掉。(3)每瓶加入每瓶加入1mL消化液（消化液（0.25%胰蛋白酶或胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），轻

24、轻摇动培养瓶，或混合液），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到经消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜薄膜”现象时，倒掉消现象时，倒掉消化液，再继续作用化液，再继续作用23分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。(4)加入完全培养基加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保，用吸管反复吹打瓶壁上

25、的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤细胞的机械损伤(5)用计数板计数，计算细胞的浓度，并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。用计数板计数，计算细胞的浓度，并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。 24四、传代细胞的建系和维持四、传代细胞的建系和维持 1.细胞档案细胞档案要记录好，如组织来源、生物学特性（由形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有无支原体和潜存病毒等）、培养基的要求、传代换

26、液时间、扩增时间(分裂指数)，细胞的特殊遗传标志(标记染色体)等，这些记录对于保证细胞的正常生长，保持细胞的一致和经长期培养细胞特性的变异比较，都有十分重要的意义。 2.换液传代(1)细胞系的传代、换液方法与前相同，但一般都有自身的规律性，因而在继续传代时，要注意保持其稳定的规律性，这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规律而导致细胞生长特性的改变，给以后的实验带来影响。(2)多种细胞系维持传代，要严格操作程序，对所用的试剂各系不能交叉每传5代后，细胞种子均应冻存。传代时均应作好记录，培养瓶上要有明显标记，标记细胞系名称和传代的代数及传代时间。细胞种子的及时冻存不仅可防止污染丢

27、失，而且还可防止因盲目传代而造成细胞变异，此外还可提供不同代次的细胞同时进行对比试验。3.细胞系（或株）的鉴定和管理25细胞的纯化和克隆细胞的纯化和克隆一、细胞的纯化一、细胞的纯化(一一)自然纯化自然纯化自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的目的。 (二二)人工纯化人工纯化1、细胞因子依赖纯化法、细胞因子依赖纯化法人和动物组织中

28、某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和生长繁殖人和动物组织中某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和生长繁殖 2、酶消化法、酶消化法不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的，对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。者分开，达到纯化的目的，对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。 3、机械刮除法、机械刮除法4、反复贴壁法、反复贴壁法5、电烙筛选法、电烙筛选法26二、细胞的克隆化二、细胞的克隆化细胞克隆技术又

29、称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株 (cell strain)。 1.毛细管法毛细管法 2.有限稀释法有限稀释法 3.平皿克隆分离法平皿克隆分离法4.软琼脂克隆分离法软琼脂克隆分离法5单细胞显微操作法单细胞显微操作法272829按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型