贴壁细胞培养

1、贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640培

2、养液PBS0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100卩g/m溶液，使用前稀释至所需浓度。（二）操作：.制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3X10个/mL,接种于12孔板，1000卩孔。PBS过一遍，力卩1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取1

3、00卩到EP管混合，取10卩细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。Mix。）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。重复。直到需要的细胞数。12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000，设6组0,0.33,0.66,1.33,2.66,3.994.66卩g/r药物组，每组2复孔，转染后置37C,5%CQ,饱和湿度条件培养箱内孵育7天。计数：满体积2000ul其中药物浓度100ug/ml100ulNS:0100N=20.33卩g/ml*2000ul=100ug/ml*

4、XX=6.6ul+NS93.4ulN=20.66卩g/ml*2000ul=100ug/ml*XX=13.2ul+NS86.8ulN=21.33卩g/ml*2000ul=100ug/ml*XX=26.6ul+NS73.4ulN=22.66卩g/ml*2000ul=100ug/ml*XX=53.2ul+NS46.8ulN=23.99卩g/ml*2000ul=100uml*XX=79.8ul+NS20.2ulN=14.66卩g/ml*2000ul=100ug/ml*XX=93.2ul+NS6.8ulN=1eg:5-FU6.6*3+NS93.4*3mix在EP管中。等待加药。N=2.吸去培养液，加入P

5、BS洗涤后，染色，干燥：刘氏染色法加LiuASolution0.5ml染色30s滴加LiuBSolution1ml于A液上面，轻吹使其充分混合，染色1min。水洗，干燥、拍照二、细胞传代原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。材料与方法（一）用品：含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液PBS0.25%胰酶、EP管，细胞（二）操作：制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，PBS过一遍，力卩1ml0

6、.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100卩到EP管混合，取10卩细胞计数用。细胞传代：在之前制备的细胞悬液2.5ml中，用滴管吸取1/3滴管至细胞培养瓶，后用滴管吸取3滴管含10%新生牛血清的RPMI-1640至细胞培养瓶，关紧瓶盖用酒精棉球搽拭后，放入37C5%CO培养箱中孵育。三、MTT比色法原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。商品名噻唑蓝，MTT。活细

7、胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。而死细胞无此功能。二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。与其他检测方法如细胞计数法，3H掺入法，LDH法有良好的相关性。材料与方法（一）用品：1MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，力卩50mlPBS（0.01M，pH7.4）在电磁力搅拌仪上搅拌30min。用0.22um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。2. 10%新生牛血清的RPMI-1640,0.25%胰酶，DMS

8、O（分析纯）3. 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100卩g/m溶液，使用前稀释至所需浓度。（二）步骤1. 接种细胞，用0.25%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100卩到EP管中，吹打，计数。3. 配5000个细胞/120ul。用96孔板，设0,2，4，8，16，24卩g/m组每空加入120d细胞。培养。4. 第二天，加入药物40d。5. 培养48h。每孔加入MTT（5mg/ml）20d，继续培养4h。小心吸弃孔内的上清液。6. 每孔加入150d的DMSO，震

9、荡10min，570nm测吸光值。满体积160ul其中药物40d药物浓度100ug/ml（对照组加40NS）2卩g/ml*160ul=100g/ml*X4卩g/ml*160ul=100ug/ml*X8卩g/ml*160ul=100ug/ml*X16卩g/ml*160ul=100ug/ml*X24卩g/ml*160ul=100ug/ml*XX=3.2ul+NS36.8ulX=6.4ul+NS33.6ulX=12.8ul+NS27.2ulX=25.6ul+NS14.4ulX=38.4ul+NS1.6ul5-FU3.2*4NS36.8*4mix在EP管中。等待加药。CCK-8法步骤1. 接种细胞，用0.25%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取