细菌β淀粉酶活力的测定LFZ

1、2013/05/10-淀粉酶活性的测定1. 原理 -淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：碱性加热糖酸还原糖淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量来表示酶活力。1 unit: 在pH4.8，20下3 min内生成1 mg麦芽糖时所消耗的酶的量。计算方法：-淀粉酶活性度=2. 仪器设备紫外分光光度计恒温水浴锅电炉制冰机离心机

2、振荡器容量瓶：50ml×1、100ml×1具塞刻度试管：15ml×8支试管：8支微量移液器3. 试剂和溶液3.1 16 mM sodium acetate buffer. pH4.8 at 20称取醋酸钠68 g溶于水，加醋酸28.6 mL，用去离子水定容至1000 mL，摇匀，即可。3.2 1% 可溶性淀粉溶液称取1.0000 g(精确度为0.001 g) 可溶性淀粉，加入80 mL左右醋酸缓冲液(pH4.8)，在电炉上加热溶解，冷却至室温，用缓冲溶液定容至100 mL，过滤(Advantec)，备用。每次实验时现场配制使用。3.3 DNS试剂(dinitros

3、alicylic acid, 3,5二硝基水杨酸，显色剂)DNS试剂(Kfri法)DNS(Sigma法)试剂名数量(g)数量(g)DNS10DSN6.3 Rocelle salt(酒石酸钾钠)(sodium potassium tartrate)200Rocelle salt176NaOH10NaOH9.4Phenol2 (1.87 mL)先用D.W.溶解NaOH，然后一点一点加入Rocelle salt溶解，待完全溶解之后，添加到DNS中。Na2S2O20.05总量1000 mL1000 mL3.4 1% Maltose标准溶液称取麦芽糖1.000克，溶于少量蒸馏水中，仔细移入容量瓶中，用蒸

4、馏水定容到100ml，即成10 mg/mL麦芽糖溶液。4. 菌种培养及粗酶液的配制4.1 种子培养基培养 从平皿培养的培养基中用接种环挑起一菌落的菌种，接种在装有50 mL无菌TSB培养基的250 mL三角瓶中，于37下恒温摇床培养16 h，转速为150 r/min，备用。4.2 菌种的生长量及其测定 取盛有50mL无菌TSB培养液的250mL三角瓶11个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h，分别加入1 mL种子培养基，于37下恒温摇床培养16 h，转速为150 r/min。选用600 nm波长，以蒸馏水作为参比，开始培养前测定培养液的OD值作为起始点。开始培

5、养后，按规定时间吸取培养液测定OD值。整个实验重复3次。将测定的OD值填入下表： 管号Ck12345678910111213OD值H2OTSB培养时间001.5346810121416182024以上述表格中的时间为横坐标，OD600 值为纵坐标，绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线。4.3 发酵摇瓶培养 把发酵摇瓶培养基装入250 mL三角瓶中，装液量为25 mL。吸取1 mL种子培养基接种于发酵摇瓶培养基中，于37下恒温摇床培养00 h，转速为150 r/min。4.4 粗酶液的制备 取发酵摇瓶培养液于25 mL无菌离心试管中，于4，6000 rpm/min，离心10 min，取上清液即为粗酶液。5

6、. 酶的活性测定5.1 Maltose标准曲线的绘制(1)不同浓度麦芽糖溶液的配制表 麦芽糖标准溶液标准溶液的浓度(mg/mL)00.20.40.60.81.02.04.0稀释倍数01/501/253/501/12.51/101/51/2.5Stock soln(uL)(conc. 10 mg/mL)020406080100200400蒸馏水(DW)添加量(uL)1 mL980960940920900800600总体积(mL)1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL取15ml具塞刻度试管8支，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、20、40、60、80、100、

7、200、400 uL，然后将各试管用蒸馏水准确补充到1000、980、960、940、920、900、800、600 uL，使总体积达到1.0 mL，摇匀。(2) 在加入DNS溶液1 mL，摇匀，在沸水浴中准确保温5 min，取出放在冰块的水浴中冷却，用蒸馏水稀释到15 mL，混匀。(3) 用分光光度计，在540 nm下比色，记录吸光值。(4) 以吸光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标，绘制标准曲线。5.2 待测样品的测定(1) 反应混合物的配制ReagentVol.(test tube)E-blankS-blank1% soluble1.00Buf. 1.001.00粗酶液1.001.00DW

8、 1.00Final vol.(mL)2.002.002.00(2) Incubation, 20, 10 min(3) Add DNS soln 1 mL 呈色反应 (1/10 vol.) Add DNS soln 0.1 mL(4) Boiling 15 min(5) Cooling in ice(6) Add DW 9 mL (1/10 vol.) Add DW 0.9 mL(7) 检测吸光度 A540 nm 6. 参考文献1Jung ST, Kim MH, Shin DH, and Kim YS. Isolation and identification of Bacillus sp.

9、 With high protease and amylase activity from Sunchang traditional Kochujiang. Korean J. Food Sci. Technol., 2000, 32(2):410-4162Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 1959, 31:426-428.3Paik HD, Kim IG, Lee JH, Lee JH, Park KY, Ji GE, Jin TE, Rhim SL. Heterologous expression of -amylase gene of Bifidobacterium adolescentis