邱侠ATP生物荧光法评价医疗器械清洗

1、ATP检测技术基础理论及在检测技术基础理论及在医院感染控制中的应用医院感染控制中的应用中国疾病预防控制中心 邱 侠2011.12.22. 目录目录lATP检测技术的理论基础lATP检测技术在医疗机构中的应用研究lATP检测技术在医院感染控制中的应用l如何进行仪器及试剂的选择ATP检测技术的理论基础（检测技术的理论基础（1）ATP主要存在于细胞内lATP（三磷酸腺苷）存在于动物细胞、微生物细胞、植物细胞中，同类活细胞内的含量基本一致；l动物细胞中ATP含量：1.000-100.000 amol ATP l细菌细胞中ATP含量：0.5-2 amol ATP；l在自然界中，绝大部分细菌的ATP含量在

2、2amol ATP，大多数体细胞ATP含量大约为1000amol ATP，因此以上述含量值分别作为细菌和体细胞的代表值；l细胞在自然凋亡的情况下，ATP含量会有变化。ATP检测技术的理论基础（检测技术的理论基础（2）0%20%40%60%80%100%ABCATPADPAMPA.活细胞活细胞B.酶融后的细胞酶融后的细胞C. 细胞自然凋亡或受到其它介质影响细胞自然凋亡或受到其它介质影响后后ATP的情况的情况ATP（三磷酸腺苷）ADP（二磷酸腺苷） AMP（一磷酸腺苷）ATP, ADP and AMP 在活的和死亡细胞内的情况ATP检测技术的理论基础（检测技术的理论基础（3）技术原理l沾染在物体表

3、面、医疗器械上的血液、组织液等体液中含有大量的体细胞和细菌等污染物，这些生物污染可以通过ATP生物荧光法测出。l萤光素酶在Mg2、ATP、O2的参与下进行酶促反应放出光子l仪器定量测定发光值RLU或使用ATP标准品测得含量，从而获知污染物污染水平，来判断物表、器械的污染程度和清洗效果污染程度和清洗效果。l通过使用体细胞通过使用体细胞ATPATP消除技术，可对残留细菌进行检测消除技术，可对残留细菌进行检测。l现有技术可以检测到1 amolATPATP的应用的应用l洁净度检测（ATP总量检测） 细胞外ATP体细胞ATP 微生物细胞ATP 可用于卫生监测、微生物生长控制等l细菌细胞计数利用体细胞裂解

4、剂ATP水解酶去除细胞外和体细胞ATP 可用于细菌总数检测、药敏试验、疾病诊断（如菌尿检测）等l体细胞计数 ATP水解酶去除细胞外ATP 可用于体细胞计数、药敏试验等ATP检测技术在医疗机构应用研究检测技术在医疗机构应用研究研究背景 2005年卫生部消毒标准委员会、中国疾病预防控制中心消毒检测中心联合北京创新世纪生化科技发展有限公司、瑞典BioThema公司和美国Hygiena国际公司在国内率先开展了ATP检测技术的基础理论、医疗器械清洗效果、医用清洗剂质量评价、临床应用等方面的研究。 本研究成果在医用清洗剂卫生标准、医院消毒卫生标准国标制定中用于评价医用清洗剂质量和医疗器械洁净度筛查，并发表

5、了多篇论文、论著。 国外技术支持国外技术支持lBioThema公司：l其创始人Dr. Lundin从事ATP研究近40年，担任生物发光和化学发光国际协会理事和生物发光和化学发光科学杂志的欧洲编委，并发表了60多篇ATP方面的各类论文及专著，在该领域享有极高的声望；l其公司的ATP标准品通过了瑞典标准机构的认证作为标准物质；l目前正在协助中国CDC制定基于ATP含量检测的国家标准；lHygiena公司：l是世界最大的ATP检测专业公司之一；l公司通过美国FDA认证；l其英国分公司配合英国卫生部开展了大量医疗应用的研究。研究报告研究报告研究报告分为三部分：研究报告分为三部分：1 1）ATPATP生

6、物荧光法评价医疗器械清洗效果的研究；生物荧光法评价医疗器械清洗效果的研究；2 2）目测、放大镜下观察、潜血试验和）目测、放大镜下观察、潜血试验和ATPATP生物荧光法对清洗生物荧光法对清洗后的医疗器械清洗效果评价结果的比较；后的医疗器械清洗效果评价结果的比较；3 3）临床研究及验证）临床研究及验证第一部分第一部分ATPATP生物荧光法评价医疗器械清洗效果的研究生物荧光法评价医疗器械清洗效果的研究试验一试验一 ATP生物荧光法与细菌计数法的相关性研究生物荧光法与细菌计数法的相关性研究取37培养1824hATCC6538，以TSB洗菌，制成菌悬液，梯度稀释图1试验一方法流程图1. 金黄色葡萄球菌（

7、ATCC6538）测定结果：菌落计数菌落计数相对光单位相对光单位CFULog (CFU)RLULog （RLU）2.791088.4545829016.662.781077.4423217006.372.761066.446999315.852.811055.45810964.912.751044.4481603.912.821033.459852.992.821022.451762.252.75101.441202.08图2金黄色葡萄球菌菌落数对数值与RLU对数值的线性关系表中cfu和RLU值均为5次试验结果平均值。大肠杆菌（大肠杆菌（8099） 2. 大肠杆菌（8099）测定结果：菌落计数

8、菌落计数相对光单位相对光单位CFULog (CFU)RLULog （RLU）7.021088.8546634856.676.991077.8421136426.336.871066.846663695.826.901055.841049565.027.011044.8594023.976.921033.8412423.096.891022.841382.146.99101.84291.46取37培养1824h8099，以TSB洗菌，制成菌悬液梯度稀释图3 试验一方法流程图图4大肠杆菌菌落数对数值与RLU对数值的线性关系表中cfu和RLU值均为5次试验结果平均值。试验二 ATP生物荧光法测定血液

9、残留量1. 对不同稀释度血液的RLU观察：血液稀释度血液稀释度相对光单位相对光单位稀释度Log (倍数)RLULog （RLU）1.010-2- 252977566.721.010-3- 328780836.461.010-4- 46065645.781.010-5- 5738074.875.010-6- 5.3351734.552.510-6- 5.6194844.291.010-6- 682073.911.010-7- 711813.071.010-8- 82872.461.010-9- 91792.25图6 血液稀释倍数对数值与RLU对数值的线性关系图5 试验二方法流程图试验三试验三 A

10、TP生物荧光法测定超声波清洗器清洗前后血液残留量生物荧光法测定超声波清洗器清洗前后血液残留量A. 清洗液清洗5min+水洗1minB. 水洗6minC. 清洗液清洗2min+水洗1minD. 水洗3min取50 L血液滴染于齿部 不同血液浓度、不同清洗条件，ATP生物荧光法测定结果：血液血液浓度浓度清洗液清洗清洗液清洗5min+水洗水洗1min水洗水洗6min清洗液清洗液清洗清洗2min+水水洗洗1min水洗水洗3min清洗前清洗前对照对照血液14385163201178731196234588464710-195687111956136528158968358974210-247164626

11、686731095614284647910-31319442481287417755598947910-4212724982700266214466010-510221339117113611185410-63844406307152287图7 试验三方法流程图阴性对照为16、18、19和15。试验四试验四 细菌计数、细菌计数、ATP生物荧光法测定超声波清洗生物荧光法测定超声波清洗器清洗前后细菌残留器清洗前后细菌残留取10 L金葡菌液滴染齿部置5mLTPS管中A. 清洗液清洗2min+水洗1minB. 水洗3minC. 清洗液清洗5min+水洗1minD. 水洗6min 1. 在超声波清洗器中

12、，水洗与清洗液清洗后，细菌计数法和ATP生物荧光法测定结果：组别组别ATPATP生物荧光生物荧光法（法（RLU）细菌计数法细菌计数法（CFU）清洗液清洗2min+水洗1min162207清洗液清洗5min+水洗1min131152水洗3min349325水洗6min136157阳性对照291091105图8 试验四方法流程图阴性对照：细菌计数为0 cfu，ATP生物荧光法测定RLU为14。. 2. 根据金黄色葡萄球菌菌落数对数值与RLU对数值的线性关系y=1.3199x 0.8317，计算出不同清洗条件下残留菌数的RLU理论值。理论值与实际值相比见下表：组别组别RLURLU理论值（理论值（Lo

13、g10Log10）RLURLU实测值（实测值（LogLog）清洗液清洗2min+水洗1min2.382.32清洗液清洗5min+水洗1min2.282.18水洗3min2.532.51水洗6min2.292.20阳性对照4.414.46第一部分第一部分 小小 结结l1.1.金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分属革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分属革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，在室温下分别对两种细菌不同稀释度菌液的在室温下分别对两种细菌不同稀释度菌液的RLURLU进行测定，结果显进行测定，结果显示，在示，在10102 210108 8cfucfu范围内，菌落数对数值与范围内，菌落数对数值

14、与RLURLU对数值之间呈线对数值之间呈线性关系（性关系（R R2 20.990.99，P P0.010.01），说明两种细菌均可以通过测定），说明两种细菌均可以通过测定RLURLU确定细菌数量。确定细菌数量。l2.2.对室温下不同稀释度的血液进行了测定，分析结果显示，血液对室温下不同稀释度的血液进行了测定，分析结果显示，血液稀释到稀释到1010-2-21010-9-9时，随着血液稀释度的增加，时，随着血液稀释度的增加，RLURLU逐渐降低，对采逐渐降低，对采自同一个人的血液，血液稀释倍数的对数值与自同一个人的血液，血液稀释倍数的对数值与RLURLU对数值之间成线对数值之间成线性关系（性关系（

15、R R2 2=0.9803=0.9803），说明测定），说明测定RLURLU可以确定血液含量，最低可可以确定血液含量，最低可以测到稀释以测到稀释1010-9-9的血液。的血液。 l3. BT-112D3. BT-112D检测系统，测定超声波清洗器清洗前、后血液残留：检测系统，测定超声波清洗器清洗前、后血液残留：l3.1 3.1 相同浓度污染物污染医疗器械，相同清洗时间，清洗液清洗组相同浓度污染物污染医疗器械，相同清洗时间，清洗液清洗组RLURLU显著低于水洗组显著低于水洗组RLURLU，二者之间有显著性差异（，二者之间有显著性差异（P P0.050.05），），这与清洗液松解有机物，使其从器械

16、表面脱落有关。这与清洗液松解有机物，使其从器械表面脱落有关。l3.2 3.2 相同浓度污染物污染医疗器械，清洗时间越长，相同浓度污染物污染医疗器械，清洗时间越长，RLURLU之越低。之越低。l4. 4. 细菌计数、细菌计数、BT-112DBT-112D检测系统，测定超声波清洗器清洗前、后检测系统，测定超声波清洗器清洗前、后细菌残留：细菌残留：l4.1 4.1 通过细菌计数和通过细菌计数和ATPATP生物荧光测定结果可以发现，在超声波清生物荧光测定结果可以发现，在超声波清洗器中清洗液清洗洗器中清洗液清洗2min+2min+水洗水洗1min1min和单纯水洗和单纯水洗3min3min相比，清洗液相

17、比，清洗液有利于去除细菌，清洗液清洗组和水洗组之间的细菌数和有利于去除细菌，清洗液清洗组和水洗组之间的细菌数和RLURLU皆有皆有显著性差异。显著性差异。l4.2 4.2 通过超声波清洗器清洗前后，细菌计数结果与标定菌量和通过超声波清洗器清洗前后，细菌计数结果与标定菌量和RLURLU通过拟合公式计算的理论值及实测值相吻合。通过拟合公式计算的理论值及实测值相吻合。l第二部分 目测、放大镜下观察、潜血试验、BT-112D检测系统测定直接清洗液清洗与预洗后清洗液清洗血液残留试验一试验一 潜血试验和潜血试验和ATP生物荧光的灵敏度比较生物荧光的灵敏度比较1、潜血试验和ATP生物荧光法测定血液残留结果：

18、取50 L血液滴染于齿部图9 试验一方法流程图分子代表阳性样本数，分母代表检测样本数；阴性对照不变色。ATP生物荧光法测定阴性对照RLU为16、18、17、19和15。.试验二试验二 放大镜、潜血试验和放大镜、潜血试验和ATP生物荧光的灵敏度比较生物荧光的灵敏度比较取50 L血液滴染于齿部A.清洗液浸泡5minB.清洗液浸泡2min流动水冲洗刷洗1.5min流动水预洗30s图10试验二方法流程图试验结果试验结果样本号样本号放大镜下观察放大镜下观察潜血试验结果潜血试验结果样本号样本号 放大镜下放大镜下潜血结果潜血结果1112123134145156167178189191020样本号样本号放大镜

19、下放大镜下潜血结果潜血结果样本号样本号 放大镜下放大镜下潜血结果潜血结果 11121231341451561671781891910201. 预洗组1.1 预洗后清洗液浸泡2min组，潜血试验检测结果：1.2 预洗后清洗液浸泡5min组，潜血试验检测结果：代表阴性，代表阳性，潜血试验阳性对照为蓝色，阴性对照不变色2. 直接清洗液浸泡组2.2 清洗液浸泡2min组、5min组，潜血试验检测结果：组组 别别样本数（件）样本数（件）放大镜下观察阳性数（件）放大镜下观察阳性数（件）潜血试验阳性数潜血试验阳性数清洗液浸泡2min20820清洗液浸泡5min20720代表阴性，代表阳性，潜血试验阳性对照为

20、蓝色，阴性对照不变色3. ATP生物荧光法测定结果3.1 预洗后清洗液浸泡2min组，放大镜下观察与ATP生物荧光测定结果：样本号样本号 放大镜下放大镜下 RLU样本号样本号 放大镜下放大镜下 RLU1580111584621162412657839587131196841114214426051268115178886174401612901710941171087381451018131639910819104161075712015799阳性对照RLU为4846479、5426617、5329203、5115037、4838111；阴性对照RLU为15、16、18、19、18.3.2 预

21、洗后清洗液浸泡5min组，放大镜下观察与ATP生物荧光测定结果：样本号样本号放大镜下放大镜下 RLU样本号样本号放大镜下放大镜下 RLU11084111947242771217023186213249344596144329587715359364368161740741521742148328718487494851192609101743201741阳性对照RLU为4846479、5426617、5329203、5115037、4838111；阴性对照RLU为15、16、18、19、18.第二部分第二部分 小小 结结l1. 1. 污染有污染有1010-6-6血液稀释液的医疗器械，潜血试验结

22、果皆为阴性，测血液稀释液的医疗器械，潜血试验结果皆为阴性，测不出血液残留，而不出血液残留，而ATPATP生物荧光法仍可定量测出，说明生物荧光法仍可定量测出，说明BT-112DBT-112D检检测系统，检测血液残留时比潜血试验更为灵敏。测系统，检测血液残留时比潜血试验更为灵敏。l2. 2. 预洗后清洗液浸泡组、直接清洗液浸泡组，共清洗样本预洗后清洗液浸泡组、直接清洗液浸泡组，共清洗样本120120件。件。肉眼观察全为阴性，但放大镜下观察，阳性数为肉眼观察全为阴性，但放大镜下观察，阳性数为3535件，这可能因件，这可能因为止血钳齿部凹凸不平，且难以观察到粒径为止血钳齿部凹凸不平，且难以观察到粒径5

23、050 mm污物有关。污物有关。l3. 3. 本试验中，对肉眼观察皆为阴性的本试验中，对肉眼观察皆为阴性的8080件样本进行潜血试验，结件样本进行潜血试验，结果显示，潜血试验阳性的样本为果显示，潜血试验阳性的样本为6666件，阳性率为件，阳性率为82.5%82.5%。说明，。说明，检测血液残留时，潜血试验优于目测法。检测血液残留时，潜血试验优于目测法。l4. 在预洗后清洗液浸泡在预洗后清洗液浸泡5min组的组的40件样本中，随机抽取件样本中，随机抽取20件进行件进行潜血试验，阴性样本数为潜血试验，阴性样本数为14件；另外件；另外20件样本进行件样本进行BT-112D检测检测系统，测得系统，测得

24、RLU值为值为8774874。说明，潜血试验测定为阴性的样。说明，潜血试验测定为阴性的样本，本，ATP生物荧光法仍可能测出血液残留。生物荧光法仍可能测出血液残留。l5. 试验中发现，放大镜下观察为阳性，其潜血试验不一定为阳性试验中发现，放大镜下观察为阳性，其潜血试验不一定为阳性；某些放大镜为阳性的样本，其；某些放大镜为阳性的样本，其RLU值却未必高。这可能因为清值却未必高。这可能因为清洗后的器械，仍有非有机物残留，如锈迹，因此在器械清洗后，洗后的器械，仍有非有机物残留，如锈迹，因此在器械清洗后，除锈亦非常重要。除锈亦非常重要。l6. 综上，测定血液残留灵敏性排序为：综上，测定血液残留灵敏性排序

25、为：ATP生物荧光法潜血试生物荧光法潜血试验验 放大镜下观察放大镜下观察 目测。目测。RLU2000作为评价器械清洗效果参考值的依据作为评价器械清洗效果参考值的依据l研究表明清洗剂中含有的表面活性剂可破坏体细胞，使胞内ATP下降并释放出来；l在ISO /TS15883 - 5的B.6.8 中提到，每个测试块(片)上细菌数 1.0 107 cfu,要求清洗后细菌的最小减少系数(RF)为4。即医疗器械清洗后,其细菌残留 1.0 103 cfu，此时通过拟合公式（y=1.3199x 0.8317）计算对应的RLU为800-1000，洁净度检测采集到的样本为总ATP（胞外ATP和细胞内ATP）应考虑到

26、细菌细胞外的ATP残留；l结合国外相关研究及在国内的基础研究、临床验证，给出BT-112D荧光仪的清洗效果评价参考值：lRLU（相对发光值）2000为低风险（合格）l为了遵循ISO持续改进的原则引入风险控制理论：lRLU（相对发光值）20004000为中度风险（警告），4000为高度风险（不合格）第三部分临床研究及验证腔镜器械清洗效果评价腔镜器械清洗效果评价研究对象：腹腔镜（目镜、操作钳、柄钳管腔、穿刺器）取样：随机抽样30套（拆卸成4个/套，共120个部件）腔镜清洗方法：按卫生部内镜清洗消毒技术操作规范（2004年版）要求采样时间：清洗前、初洗后、酶浸泡刷洗后、超声清洗后、风吹干或干燥箱后采

27、样方法：采样面积按国标医院消毒卫生标准GB 15982-1995要求； 佩戴无粉、无菌手套及一次性口罩、帽子； 从Ultrasnap试管 中取出拭子，持器械手柄端，在器械表面往 返均匀涂擦各5次。评价方法：RLU（相对发光值）2000低风险，20004000中度风险，4000高度风险分析：1、 600例检测中，通过初洗、酶洗、超声洗、风吹干燥或干燥炉干燥后ATP含量100%呈下降趋势；2、整体合格率74%；3、目镜：由于不能超声清洗，30例平均值5502；4、柄钳管腔：超声清洗后RLU值升高，经核实由超声清洗机二次污染造成；5、通过环节控制可找到清洗中薄弱环节；6、通过环节控制可以提高清洗合格

28、率，符合ISO持续改进的要求。柄钳管腔1号2号10号11号12号清洗前7223758792810426660213668184416176初洗后11264622474203052688931309酶擦冲水后20911693219713243390超声冲水后435514202301718574446机械清洗器械效果评价机械清洗器械效果评价 我公司历时2年在全国范围内，对近150家医院的消毒供应中心提供复用医疗器械洁净度检测服务，积累了近5000例检测数据。采样时间：清洗干燥后进行采样；采样方法：佩戴无粉、无菌手套及一次性口罩、帽子。非管腔类：从Ultrasanp试管中取出拭子，持器械手柄端，在器

29、械表面横竖往返均匀涂擦各5次，并随之转动拭子，器械齿部和关节部等难清洗的部位可着重涂抹。手拿部位不涂抹，将采样后的拭子放回试管；管腔类：在器械表面横竖往返均匀涂擦各5次，并将拭子探入管腔内，往返旋转涂抹5次，拭子从管腔两端各探入9cm，管腔长度小于18cm的采集管腔全部，大于18cm的只采18cm。手拿部位不涂抹，将采样后的拭子放回试管。（拭子无法探 入管腔类器械可检测100l洗脱水并用100l冲洗用水作阴性对照）。检测： 掰断拭子上端的速流阀，挤下试剂并振荡15次，放入仪器检测。结果判定：RLU（相对发光值）2000合格，20004000中度风险，4000高度风险检测中发现的问题检测中发现的

30、问题1、每次采样以止血钳、宫吸管、弯盘、骨穿针（针柄）、冲洗水 为主，总体合格率为78 %；2、器械放入清洗机，码放密度不同会影响清洗质量；3、器械放入清洗机，码放方式不同会影响清洗质量；4、宫吸管等管腔器械预洗方式不同，会影响清洗质量；5、骨穿针（针柄）问题较多；6、RLU（相对发光值）2000合格，20004000中度风险，4000高度风险的控制指标的提出，使清洗质量有了量化标准和改进的目标，符合ISO持续改进的要求。国外研究及应用案例国外研究及应用案例采用采用ATP检测技术院内感染控制流程检测技术院内感染控制流程有效降低院内感染风险有效降低院内感染风险血液透析和相关治疗用水复用医疗器械手卫生统计分析BT-112DPlusBT-112D物体表面内窥镜和手术器械内窥镜和手术器械l“我们得到结论ATP生物荧光法不会完全取代传统生物培养法，但是可以成为复用内窥镜清洗效果的另一新方法。ATP生物荧光法作为传统生物培养法一种