通心络胶囊干预载脂蛋白E基因敲除小鼠冠状动脉粥样硬化形成机理的

1、通心络胶囊干预载脂蛋白E基因敲除小鼠MMP-1、MMP-9及TIMP1的研究Study of Tongxinluo Capsule in Intervention of Apolipoprotein E Gene Knocking Out MMP-1, MMP-9 and TIMP1 in Mice 韩 旭 李七一 夏卫军 赖仁胜 陈小虎 郭宏敏 赵 惠Han Xu, Li Qiyi, Xia Weijun, Lai Rensheng, Chen Xiaohu, Guo Hongmin, Zhao Hui江苏省中医院（中国 210029）Traditional Chinese Medicine

2、 Hospital in Jiangsu Province ( China, 210029)中图分类号：R285.6 文献标识码：A 文章编号：18180086（2010）04摘 要：目的 通过通心络胶囊对载脂蛋白E基因敲除ApoE（-/-）模型组小鼠基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）水平等指标的干预变化，探究其治疗冠心病（CHD）的机理。方法 将40只ApoE （-/-）小鼠作为实验组，建立冠状动脉粥样硬化（AS）模型，随机分为模型组等5组，分别给予辛伐他汀及不同剂量的通心络胶囊进行干预，另选8只同系的小鼠作为正常对照

3、组。通过对模型组小鼠血清MMP-1、MMP-9 和TIMP1水平的观察，比较分析通心络胶囊对ApoE （-/-）小鼠冠状AS的调节作用并探讨其机理。结果通心络胶囊高剂量组小鼠血清MMP-1和MMP-9水平均低于模型组，而TIMP1水平高于模型组，与模型组相比，均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。通心络胶囊中剂量组小鼠血清MMP-9水平低于模型组，与模型组相比有统计学意义（P<0.05）。结论通心络胶囊具有抑制血管重构和稳定斑块的作用。关键词：通心络胶囊；ApoE（-/-）小鼠；冠状AS；MMP-1；MMP-9；TIMP1；干预Abstract Objectives

4、To investigate mechanism of Tongxinluo Capsule managing coronary heart disease (CHD) by observing changes resulting from intervention of apolipoprotein E gene knocking out ApoE (-/-) MMP-1, MMP-9 and TIMP1 in mice model. Method 40 ApoE (-/-) mice, as experimental group, were used to establish corona

5、ry arteriosclerosis (AS) model and then were randomly divided into 5 model groups. Simvastatin and Tongxinluo Capsule at different dosage were administrated to mice respectively as intervention and 8 mice of same kind were selected as control group. Tongxinluo Capsule's effect in regulating coro

6、nary AS in ApoE (-/-) mice and its mechanism were compared and analysed during the experiment by observing serum MMP-1,MMP-9 and TIMP1 levels in model mice. Results in group administrated high dose Tongxinluo Capsule, serum MMP-1 and MMP-9 level were lower than that in model group without interventi

7、on, but TIMP1 was higher. The difference is significant statistically (P<0.05 or P<0.01). In the group administrated moderate dosage Tongxinluo Capsule, the serum MMP-9 was lower than that in model group without intervention, which also has statistical significance (P<0.05). Conclusion Tong

8、xinluo Capsule is of some effect in the inhibition of vascular remodeling and stabilization of plaques.Key words Tongxinluo Capsule, ApoE (-/-) mice, coronary AS, MMP-1, MMP-9, TIMP1, intervention 1 实验材料1.1 药品与试剂通心络胶囊：石家庄以岭药业股份有限公司生产，规格：每粒0.38克。批号：20060501。MMP-1、MMP-9、TIMP1测定试剂盒，购自晶美生物工程有限公司，美国Orion

9、o Diagostica公司生产，批号：00604。 胆固醇，上海生化试剂厂，批号：051124。1.2 实验动物ApoE（-/-）小鼠，40只，鼠龄8周龄，雌雄各半，体重18-22g。（品系C57BL/6J，购自美国Jackson实验室）由北京大学实验动物中心提供。同遗传背景C57BL/6J小鼠8只，鼠龄8周龄，雌雄各半，体重18-22g。动物生产许可证号： SCXK（京） 2002-0001。南京中医药大学实验中心，实验动物使用许可证：SYXK（苏）2002-0123。1.3 实验仪器SYSMAX全自动生化分析仪 日本SYSMEX公司TGL·16G台式高速离心机 上海医用分析仪器

10、厂UN754分光光度计 上海第三分析仪器厂JA2003分析天平 上海天平仪器厂AUP-2-35G-01 实验室级专用超纯化水机 重庆颐洋实业有限公司DKZ2型电热恒温振荡水槽上海精宏实验设备有限公司LDZ52低速自动平衡离心机 北京医用离心机厂LRB-12752计数器 芬兰 1.4 实验条件小鼠单笼饲养，自由饮水，室温20±2。2 实验方法2.1 高脂饲料配制方法以5%胆固醇，10%猪油，0.1%丙基硫氧嘧啶，加入小鼠标准饲料粉中。饲料粉经充分混合后由江苏省青龙山动物养殖场加工成颗粒饲料。2.2 ApoE（-/-）小鼠冠状动脉粥样硬化建立ApoE（-/-）小鼠适应性喂养一周后给予高脂

11、饲料，连续喂养12周。同时选取相同遗传背景的8周龄正常C57BL/6J小鼠8只，雌雄各半作为正常对照组，2.3 给药方法和剂量2.3.1 正常对照组 喂普通颗粒小鼠饲料，同时给予等量蒸馏水。2.3.2 模型组：喂高脂饲料，同时给予等量蒸馏水。2.3.3 通心络胶囊1组 除与模型对照组相同外，给予通心络胶囊2g（生药）/kg体重。2.3.4 通心络胶囊2组 除与模型对照组相同外，给予通心络胶囊4g（生药）/kg体重。2.3.5 通心络胶囊3组 除与模型对照组相同外，给予通心络胶囊8g（生药）/kg体重。2.3.6 辛伐他汀组 除与模型对照组相同外，给予辛伐他汀0.05g/kg体重。2.4血清MM

12、P-1、MMP-9、TIMP1 浓度水平测定采用定量夹心酶免疫分析技术。3 统计分析方法描述性统计分析，定性指标以频数表，百分率或构成比描述；定量指标以均数，标准差描述。两组对比分析，定性资料采用卡方检验，Fisher精确概率法，Wilcoxon秩和检验，CMH c2检验。定量资料符合正态分布用t检验（组间进行方差齐性检验，以0.05作为检验水准，方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验），不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验，Wilcoxon符号秩和检验。假设检验统一使用双侧检验，给出检验统计量及其对应的P值。以P0.05作为有统计学意义，以P0.01作为有高度统计学

13、意义。以上统计分析均用SAS统计软件进行处理。4 实验结果从表1中可见，ApoE（-/-）小鼠造模后12周，模型组ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1和MMP-9水平显著升高，而TIMP1水平显著降低，与正常组相比，均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。通心络胶囊高剂量组ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1和MMP-9水平均低于模型组，而TIMP1水平高于模型组，与模型组相比，均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。通心络胶囊中剂量组ApoE（-/-）小鼠血清MMP-9水平低于模型组，与模型组相比，有统计学意义（P<0.05）。表1 通心络胶囊对Ap

14、oE（-/-）小鼠血清MMP-1、MMP-9及TIMP1水平的影响（g/L，X±S）分 组剂量（g/Kg）动物数（n）MMP-1MMP-9TIMP1正常组8290.88±15.36482.63±47.65 157.88±21.56模型组-8 330.63±38.33 805.63±120.14 63.38±11.76低剂量组28308.88±50.30656.63±83.23*70.25±22.63中剂量组48312.13±38.68666.88±137.89* 87.25&

15、#177;30.41高剂量组88 283.63±38.64*648.88±112.15* 93.88±25.48*辛伐他汀组0.058 293.75±28.71* 568.50±104.49* 88.75±24.59*注：与正常组相比，P<0.01，P<0.05；与模型组比较，* P<0.05，* P<0.01。5讨论AS的形成涉及脂质代谢紊乱、血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移和增殖等。大量研究已证实，细胞外基质（ECM）合成或降解失衡是AS形成过程中十分重要的环节，AS形成过程也是ECM重建即血管重构的过程2

16、。基质金属蛋白酶（MMPs）是一族可降解ECM胶原的重要蛋白酶类，在AS发生期可促进VSMC向内皮的移位，其在分解冠脉粥样斑块纤维帽ECM，使纤维帽变薄、易于破裂方面起着重要作用3。研究发现，粥样斑块组织中，尤其是纤维斑块的肩部可检出大量巨噬细胞及多种MMPs。在泡沫化过程中多种细胞因子调节其他细胞分泌大量MMPs进一步降解ECM，促使脂质条纹的形成并加速粥样斑块的发展4。MMP-1是MMPs家族重要的一员，主要降解间质胶原、X型胶原和蛋白聚糖的核心蛋白。研究表明MMP-1的表达及活性增强与CHD的发生、发展密切相关5。Nikkari等6报道人类AS斑块脂质核心强烈表达MMP-1，通过降解型和

17、型胶原蛋白，使纤维帽变薄，促进粥样斑块进入不稳定状态。另外，原位酶谱实验证明人的粥样斑块，尤其是机械张力最高之处，MMP-1表达增加7倍，而该处又是斑块破裂常见之处，据此推测，在这些部位基质降解过度同时又有机械张力过度而使纤维帽破裂7。MMP-9是MMPs家族中明胶酶的一种，研究表明8，MMP-9与AS关系密切，可以高效降解基底膜的主要成分IV型胶原。Brown等9报道MMP-9通常在新近斑块破裂的冠状动脉旋切标本中表达。Peterson等10研究发现MMP-9含量在不稳定心绞痛病人斑块组织中明显高于稳定型心绞痛病人，MMP-9的过表达，可使ECM降解活性增强，从而降低斑块强度，促使斑块破裂。

18、冠状动脉内径狭窄程度也与MMP-9呈正相关。TIMP1为MMPs的组织抑制剂11，Inokubo等12.13.14认为正常内皮细胞和平滑肌细胞有TIMP1和MMP9的表达，且两者处于平衡状态，以共同维持ECM合成与降解相对平衡，使斑块趋向稳定，不易破裂。MMP-9升高、TIMP1的降低预示着硬化斑块的不稳定或破裂。在急性冠状动脉综合征的发生过程中，MMP-9表达增加大于TIMP1表达增加，使冠状AS斑块纤维帽的胶原降解大于合成，导致斑块脆性增加并最终破裂15。George16研究证实用TIMP1或调节其与MMP-9之间的比例可起到治疗AS的作用。我们既往研究提示：通心络胶囊具有抑制ApoE (

19、-/-)小鼠冠状AS的作用17，本实验结果表明该药还能通过抑制MMP-1、MMP-9和升高TIMP1血中浓度而具有抑制血管重构和稳定斑块作用，且其强度与药量的大小有关，推测其机制可能为：抑制VSMC的增殖和移行，调节ECM的合成和降解，稳定斑块纤维帽。参考文献：1 JnaLBreslwoMouse models of atheroselerosisJSeinece1996，V0L272：685-6882 温进坤,韩美.基质金属蛋白酶与血管壁细胞外基质重建J.生命的化学,2002;22(5):461-463.3 Shah PK,Falk E, Badimon J J,etal. Humanmon

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24、y atherosclerotic lesions,Association of active enzyme synthesis with unstable anginaJ.Circulation, 1995;91:2125-2131.10 Peterson M,Porter KE,Loftus IM, et al. Marimastat inhibits neointimal thickening in a model of human arterial intimal hyperplasiaJ. Eur J Vasc Endovasc Surg.2000,19:461-467.11 Cai

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