一种新型基因工程技术手段

1、 Red/ET重组技术原理：Red/ET重组是新近出现的一种基于噬菌体Red操纵子（Red/Red/Red）和Rac噬菌体RecE/RecT重组系统的DNA工程技术。它是一种不依赖于限制性内切酶的分子克隆新技术。运用该技术能够介导PCR产物或寡核苷酸对目标基因进行以简单、快速地剪切、插入、融合及突变等多种操作修饰，而且还可对长达80kb的DNA片段进行亚克隆。由于重组反应的整个过程都是在大肠杆菌细胞内部完成，因此不存在碱基突变危险。该技术已被广泛地用于基因组DNA，如细菌人工染色体、大肠杆菌染色体等的遗传修饰研究,通过改变生物合成基因簇以增加表达量及基因工程药物的研究和开发中。 下面以Red/

2、ET同源重组介导细菌人工染色体的快速修饰的例子具体说明相关应用的方法步骤：背景：由于容量大操作简单以及结构与复制稳定等特点，细 菌 人 工 染 色 体（BAC）被人们认为是最理想的基因组载体,由于DNA碱基构成方式和限制性内切酶 识 别 位 点 的 序 列 要 求,对 于 像BAC(100-300kb)这样大的DNA通过依赖于限制性内切酶的传统分子克隆技术很难对其进行操作,因此，BCA的应用一直受到限制。由于 Red/ET重组技术首次展示了仅需30-50bp同源臂的同源技术，50bp的同源臂可以通过PCR 方法加载在打靶序列的两侧,也可以直接合成仅含两个同源臂的寡核苷酸序列,在同源臂与PCR引

3、物之间或两个同源臂之间还可以加入一些特殊序列，从而实现应用PCR 产物或体外合成的寡核苷酸直接对靶DNA 分子进行各种有目的修饰。由于同源臂序列既无特殊要求又不受识别位点限制，可以人为随意选择，因此该技术不仅操作简单，省时省力，而且可对各种大小分子进行操作， 尤其在BAC,PAC等大分子DNA修饰方面具有独到的优势。方法步骤：一步法BAC修饰：通过插入抗性筛选基因（neo）删除MLL BAC上多余的lox P位点1、 PCR扩增neo基因：选择目标BAC（含有小鼠MLL基因）上lox P 位点两侧各50bP的碱基序列作为同源臂A（HA）和同源臂B（BH），以含有neo基因的pACYC177质粒

4、DNA为模板，设计合成两端分别带有同源臂A,B的上下游引物，为利于检测，可引入一个Xho I识别序列。PCR扩增neo基因，回收纯化所得PCR产物。2、 电转化Red/ET依托质粒pSC101-BAD-gbaA ： 将含有MLL BAC的宿主菌单克隆过夜培养并制备感受态细胞，取1gpSC101-BAD-gbaA质粒DNA电击转化态细胞，之后涂于平板上30过夜3、 Red/ET 重组挑取过夜平板上的单克隆（此单克隆已同时含有目标BAC和依托质粒pSC101-BAD-gbaA）过夜培养，次日接种至新的培养基，振荡培养，此期间rec A等发生了短暂表达，将诱导表达后的细胞制备感受态。取0.2g带有同

5、源臂的neo基因PCR产物电击转化感受态细胞,电转后加入培养基振荡培养,最后取其一部分置于平板，过夜。4、修饰后的BAC鉴定从37过夜后的平板上挑取数个单克隆至培养基中振荡过夜，次日提取BAC DNA, Xho I酶切3h,琼脂糖脉冲场电泳检测酶切产物。应用举例：Red/ET用多个相同载体分别携带抗生素生物合成基因簇其中的一部分，利用噬菌体同源重组系统的Red/ET技术重新拼装，再导入到宿主菌内表达。该技术可简单、快速地对任意大的DNA分子进行各种修饰，并且整个过程都是在大肠杆菌细胞内部完成。Rodrìguez等通过attB-attP位点特异性重组，在糖多孢红霉菌(Sac.erythraea)的菌株K41-135中表达红霉素气微菌(Aeromicrobiume r y t h r e u m ) 的红霉素全部合成基因簇，并修饰PKSs，使红霉素产量提高明显。Red/ET技术流程图参考资料：RedET重组在基因打靶载体快速构建中的应用 王军平 张友明同源重组介导细