基因芯片技术

1、 第四节第四节 基因芯片技术基因芯片技术第一节第一节 生物芯片生物芯片 概概 述述一、基本概念一、基本概念 生物芯片生物芯片（biochipbiochip）指通过机器人自动印迹或光引导化指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检蛋白质、基因及其他生

2、物组分的准确、快速、大信息量的检测。测。第一节第一节 生物芯片生物芯片 概概 述述一、基本概念一、基本概念 狭义的生物芯片（狭义的生物芯片（biochipbiochip）概念是指通过不同方法将生）概念是指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、物分子（寡核苷酸、cDNAcDNA、genomic DNAgenomic DNA、多肽、抗体、抗原等）、多肽、抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵。因此生物芯片技术又称微陈固相递质上形成的生物分子点阵。因此生物芯片技术又称微陈列（列（microar

3、raymicroarray）技术，含有大量生物信息的固相基质称为微）技术，含有大量生物信息的固相基质称为微阵列，又称生物芯片。狭义的生物芯片就是微阵列，包括基因阵列，又称生物芯片。狭义的生物芯片就是微阵列，包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。 广义的生物芯片指一切采用生物技术制备或应用于生物技广义的生物芯片指一切采用生物技术制备或应用于生物技术的微处理器。包括用于研制生物计算机的生物芯片、将健康术的微处理器。包括用于研制生物计算机的生物芯片、将健康细胞与电子集成电路结合起来的仿生芯片、缩微化的实验室即细胞与电子集成电路结合起来的仿生芯片、缩微

4、化的实验室即芯片实验室以及利用生物分子相互间的特异识别作用进行生物芯片实验室以及利用生物分子相互间的特异识别作用进行生物信号处理的信号处理的基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等等 。第一节第一节 基基 因因 芯芯 片片 概概 述述一、基本概念一、基本概念技术是通过技术是通过微阵列微阵列技术技术, 将高密度将高密度DNA片段阵列通过片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基探针，借助碱基

5、互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。革命性技术。技术巨大优势在于它可以技术巨大优势在于它可以并行并行地地宏量宏量获取生物信息，获取生物信息，借助此技术发展的生物芯片则提供了以核酸杂交为基础的基因借助此技术发展的生物芯片则提供了以核酸杂交为基础的基因水平的表达监控，多态性和基因型的研究。从而使我们对基因水平的表达监控，多态性和基因型的研究。从而使我们对基因表达调控有更深入的了解。表达调控有更深入的了解。Solid support (glass, plastic, metal, silicon)（载体载体）Mini

6、aturized array of DNA (genetic material) （DNADNA微阵列微阵列）Hybridized probes (DNA molecules) are fluorescently labeled（荧光标记探针荧光标记探针）Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridization（分子杂交分子杂交）二、基因芯片分析流程二、基因芯片分析流程19911991年年AffymatrixAffymatrix公司福德（公司福德（FodorFodor）组织半导体专家和分子）组织半导体专家和分子生物学专家共同研制出利用

7、光蚀刻光导合成多肽；生物学专家共同研制出利用光蚀刻光导合成多肽； 19921992年运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的年运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNADNA芯芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片；片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片； 19931993年设计了一种寡核苷酸生物芯片；年设计了一种寡核苷酸生物芯片； 19941994年又提出用光导合成的寡核苷酸芯片进行年又提出用光导合成的寡核苷酸芯片进行DNADNA序列快速序列快速分析；分析； 19951995年，斯坦福大学布朗（年，斯坦福大学布朗（P PBrownBrown）实验室发明了第一块）实验室发明了第一块以

8、玻璃为载体的基因微矩阵芯片；以玻璃为载体的基因微矩阵芯片； 19961996年灵活运用了照相平板印刷、计算机、半导体、激光年灵活运用了照相平板印刷、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、寡核苷酸合成及荧光标记探针杂交等多学科技共聚焦扫描、寡核苷酸合成及荧光标记探针杂交等多学科技术创造了世界上第一块商业化的生物芯片；术创造了世界上第一块商业化的生物芯片；20012001年，全世界生物芯片市场已达年，全世界生物芯片市场已达170170亿美元，用生物芯片亿美元，用生物芯片进行药理遗传学和药理基因组学研究所涉及的世界药物市场进行药理遗传学和药理基因组学研究所涉及的世界药物市场每年约每年约18001800亿美

9、元。亿美元。高度并行性：高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。多样性：多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。微型化：微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。率。自动化：自动化：降低成本，保证质量而且降低成本，保证质量而且灵敏度高灵敏度高。四、基因芯片技术的特点四、基因芯片技术的特点第二节第二节 生物芯片的分类生物芯片的分类一、按载体材料分类一、按载体材料分类 玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯

10、片二、点样方式分类二、点样方式分类原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡 核苷酸而制备的芯片。探针较短。核苷酸而制备的芯片。探针较短。微矩阵芯片：将预先制备的微矩阵芯片：将预先制备的DNADNA片段以显微打印的方式有序地片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活。固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活。电定位芯片：利用静电吸附的原理将电定位芯片：利用静电吸附的原理将DNADNA快速定位在硅基质、快速定位在硅基质、导电玻璃上，在电力推动下进行快速杂交。导电玻璃上，在电力推动下进行快速杂交。

11、三、按生物类型分类三、按生物类型分类基因芯片基因芯片或或DNADNA芯片（芯片（GenechipGenechip）：）：是根据核酸杂交的原理，是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip) (proteinchip) ：利用抗体与抗原特异性结合即：利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，

12、形成蛋白质微阵列，实现抗原抗体的互检，相支持物上，形成蛋白质微阵列，实现抗原抗体的互检，即蛋白质的检测。即蛋白质的检测。细胞芯片细胞芯片(cellchip)(cellchip)：是将细胞按照特定的方式固定在载体：是将细胞按照特定的方式固定在载体上，用来检测细胞间相互影响或相互作用。上，用来检测细胞间相互影响或相互作用。 组织芯片组织芯片(tissuechip)(tissuechip)：是将组织切片等按照特定的方式固：是将组织切片等按照特定的方式固定在载体上，用来进行免疫组织化学等组织内成分差异研定在载体上，用来进行免疫组织化学等组织内成分差异研究。究。三、按生物类型分类三、按生物类型分类芯片实

13、验室：芯片实验室：lab-on-chip lab-on-chip 采用纳米技术，制造出微小结构：采用纳米技术，制造出微小结构：变性、分离、纯化、电泳、变性、分离、纯化、电泳、PCRPCR扩增、加样及检测，使各扩增、加样及检测，使各个实验步骤微缩于一个芯片上。个实验步骤微缩于一个芯片上。高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统。体的便携式生物分析系统。实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。析过程自动化、连续化和微缩化

14、。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。四、按芯片使用功能分类四、按芯片使用功能分类测序芯片测序芯片表达谱芯片表达谱芯片基因组芯片基因组芯片指纹图谱芯片指纹图谱芯片诊断芯片诊断芯片毒理芯片。毒理芯片。Lab on chip第三节第三节 DNADNA芯片技术的操作流程芯片技术的操作流程一一. . 芯片的制作芯片的制作准备准备 点阵设计（芯片上核酸探针序列的选择以及排布）点阵设计（芯片上核酸探针序列的选择以及排布） 固定在芯片上的生物分子样品固定在芯片上的生物分子样品 固相支持物（即芯片片基）固相支持物（即芯片片基） 制作芯片的仪器制作芯片的仪器点阵的设计

15、点阵的设计基本方阵标记基本方阵标记空白点对照空白点对照看家基因对照看家基因对照探针基因探针基因每种2或4点1. 1. 固相支持物的种类及预处理固相支持物的种类及预处理刚性支持物：玻片、硅片、瓷片刚性支持物：玻片、硅片、瓷片膜性支持物：尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜膜性支持物：尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜膜结合玻片、膜结合玻片、FAST Slides FAST Slides 等等原位合成法的支持物：衍生出羟基等活性基团原位合成法的支持物：衍生出羟基等活性基团直接点样法的支持物：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸直接点样法的支持物：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸2. 2. 芯片制备方法芯片制备方法 （1 1）原

16、位合成（）原位合成（in situ synthesisin situ synthesis）适用于：寡核苷酸）适用于：寡核苷酸 光导原位合成法光导原位合成法 原位喷印合成原位喷印合成 分子印章多次压印合成分子印章多次压印合成 （2 2）点样法适用于：大片段）点样法适用于：大片段DNADNA、寡核苷酸、寡核苷酸、mRNA mRNA 接触式点样（针式打印）接触式点样（针式打印） 非接触式点样（喷墨打印）非接触式点样（喷墨打印）原位合成法（原位合成法（in situ synthesis):in situ synthesis):又可分为原位光控合成法和原位又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用

17、于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成标准试剂合成法。适用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。美国美国AffymetrixAffymetrix公司专利公司专利光敏保护基团；光蚀刻掩膜（或蔽光膜）光敏保护基团；光蚀刻掩膜（或蔽光膜）原位合成法：原位合成法： 合成速度快、步骤少、探针数目呈指数增长、合成速度快、步骤少、探针数目呈指数增长、阵列密度高；但光蚀刻掩膜昂贵、每步产率较低，因阵列密度高；但光蚀刻掩膜昂贵、每步产率较低，因此合成探针长度较短。此合成探针长度较短。 测序、查明点突变；测序、查明点突变； 高密度

18、、根据已知的高密度、根据已知的DNADNA编制程序；编制程序； 制作复杂、价格昂贵、不能测定未知制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNADNA序列。序列。 压电打印法压电打印法类似彩色喷墨打印，但有多个芯片喷印头及储液囊，储类似彩色喷墨打印，但有多个芯片喷印头及储液囊，储液囊中装四种碱基合成试剂，喷印头在整个芯片上移动液囊中装四种碱基合成试剂，喷印头在整个芯片上移动其化学原理：固相合成其化学原理：固相合成DNADNA4050nt4050nt，产率较高，产率较高 点样法点样法设计点阵设计点阵人工合成的寡核苷酸片段；人工合成的寡核苷酸片段； PCRPCR、RT/PCRRT/PCR等扩增的等扩增的DN

19、ADNA或或cDNAcDNA片段；片段；基因组提取的基因组提取的DNADNA片段；片段；表面带正电荷的芯片支持物表面带正电荷的芯片支持物阵列点样机阵列点样机(arrayer)(arrayer)喷墨打印（非接触式）喷墨打印（非接触式）400400点点/cm/cm2 2针式打印（接触式）针式打印（接触式）25002500点点/cm/cm2 2紫外交联固定、紫外交联固定、SchiffSchiff碱连接法固定碱连接法固定Cartesian - PixSys SeriesSpotBotTM 个人化全自动芯片点样仪个人化全自动芯片点样仪二二. . 待检测样品的制备和标记待检测样品的制备和标记 1. 1.

20、待检测样品中待检测样品中mRNA mRNA 或或DNADNA的提取及纯化的提取及纯化RNARNA的稳定性的稳定性液氮或干冰液氮或干冰; ; 立即抽提立即抽提RNA RNA 保护剂保护剂纯化纯化2. RT-PCR2. RT-PCR或或PCRPCR扩增靶片段扩增靶片段 固相固相PCRPCR系统系统3. 3. 样品的标记样品的标记伴随伴随RT or PCRRT or PCR过程过程随机引物法、缺口平移法等随机引物法、缺口平移法等标记物标记物 荧光染料，如荧光染料，如Cy3Cy3、Cy5Cy5 生物素、地高辛生物素、地高辛 放射性核素，如放射性核素，如 3232P P、3333P P 化学发光化学发光

21、 金属离子金属离子AuAu和和Ag(Ag(纳米金属微粒探针纳米金属微粒探针) )双双/ /多色荧光标记多色荧光标记标记产物纯化标记产物纯化 固固相相探探针针杂交杂交结果观察，结果观察，信息分析信息分析药物处理细药物处理细胞胞总总mRNACy5标记标记未处理的细未处理的细胞总胞总mRNACy3标记标记cDNA寡核苷酸寡核苷酸Cy3、Cy5双色荧光标记结果示意图双色荧光标记结果示意图三三. . 分子杂交分子杂交芯片杂交盒、洗片器；芯片杂交仪芯片杂交盒、洗片器；芯片杂交仪杂交液杂交液清洗液清洗液影响杂交的因素影响杂交的因素时间、温度、缓冲液等，时间、温度、缓冲液等，根据芯片上核酸片段的长短、用途选择

22、根据芯片上核酸片段的长短、用途选择杂交条件杂交条件1、预制的基因芯片 2、芯片滚动杂交仪 3、全自动芯片 洗涤工作站 4、芯片扫描仪 5、分析系统12345基因表达检测基因表达检测高盐、高样品浓度、低温、长时间（过夜），严高盐、高样品浓度、低温、长时间（过夜），严谨性较低，有利于增加低拷贝基因检测的灵敏度。谨性较低，有利于增加低拷贝基因检测的灵敏度。基因突变检测基因突变检测低盐、高温、短时间（几小时），严谨性高，有低盐、高温、短时间（几小时），严谨性高，有利于鉴别出单碱基错配。利于鉴别出单碱基错配。四四. . 杂交图谱的采集和分析杂交图谱的采集和分析磷感屏成像系统磷感屏成像系统荧光芯片扫描仪荧

23、光芯片扫描仪图像分析和数据处理软件图像分析和数据处理软件基于光电倍增馆（基于光电倍增馆（PMT）的检测系统）的检测系统CCD摄像摄像32P标记标记33P标记标记6400点的基因芯片点的基因芯片 （面积（面积 12X14 mm)A successful microarray experiment: Relatively low background and high and uniform signals in this image provide a basis for comparison of the microarrays.High background Irregular spot m

24、orphology Comet tails Streaks Low signal 基因芯片分析软件AFFYMETRIXAFFYMETRIX公司公司 Geni Chip Data Mining Geni Chip Data Mining Tool(DMT)Tool(DMT)Applied Biosystems BioMergeApplied Biosystems BioMergeHitachi Genetic SlystemHitachi Genetic Slystem的的 CHIPSpaceCHIPSpace、DNASISDNASIS、DNASpaceDNASpaceBioDiscoveryB

25、ioDiscovery公司公司 GeneSightGeneSightStanfordStanford大学大学 Cluster & TreeViewCluster & TreeViewInformaxInformax公司的公司的 GenoMaxGenoMax挪威挪威BergenBergen大学大学 J-expressJ-expressAxon Instruments Inc. GenePix ProAxon Instruments Inc. GenePix ProSilicon GeneticsSilicon Genetics公司公司 GeneSpringGeneSpringIm

26、aging ResearchImaging Research公司公司 ArrayStatArrayStatApplied MathsApplied Maths公司公司 GeneMathsGeneMathsMedia CyberneticsMedia Cybernetics公司公司 Array-Pro AnalyzerArray-Pro Analyzerhttp:/ DNA DNA芯片技术操作流程图芯片技术操作流程图 芯片的制作芯片的制作直接购买商品化芯片直接购买商品化芯片自行设计并向厂方定做自行设计并向厂方定做购买芯片点样仪、玻璃片购买芯片点样仪、玻璃片基或膜；基或膜；购买购买/合成合成Oli

27、go DNA或大或大规模规模PCR扩增目的片段；扩增目的片段；点样及固定；点样及固定；自制芯片自制芯片 样品的制备和标记样品的制备和标记待测样品核酸提取与纯化待测样品核酸提取与纯化 标记标记 标记靶片段纯化标记靶片段纯化分子杂交分子杂交图像采集和软件分析图像采集和软件分析反转录标反转录标记记/PCR标标记记/随机引随机引物标记等物标记等第四节第四节 DNA芯片技术的应用芯片技术的应用一一. 巨大的应用前景巨大的应用前景1. 基因表达分析基因表达分析 2. 基因组研究基因组研究 遗传作图、基因测序、基因鉴定、基因功能分析遗传作图、基因测序、基因鉴定、基因功能分析3. 疾病的基因诊断疾病的基因诊断

28、4. 药物研究与开发药物研究与开发药物筛选、新药发现、合理用药、中草药、鉴定、真假药鉴药物筛选、新药发现、合理用药、中草药、鉴定、真假药鉴定定5. 检测基因点突变及多态性检测基因点突变及多态性6. 其他领域其他领域1. 1. 基因表达分析基因表达分析原理原理针对基因的保守区段设计针对基因的保守区段设计多对完全匹配的寡核苷酸探针多对完全匹配的寡核苷酸探针（PMPM）和与之相应的中心单碱基错配的寡核苷酸探针（）和与之相应的中心单碱基错配的寡核苷酸探针（MMMM），固定于芯片的相邻位置上，与标记的样品靶序列杂交。正常固定于芯片的相邻位置上，与标记的样品靶序列杂交。正常完全匹配的情况下（阳性），完全匹

29、配的情况下（阳性），PMPM的杂交信号明显强于的杂交信号明显强于MMMM的杂的杂交信号，而错配时（假阳性），两者的杂交信号区别不明显，交信号，而错配时（假阳性），两者的杂交信号区别不明显，（PM / MMPM / MM）信号的比值可作为衡量阳性的指标。）信号的比值可作为衡量阳性的指标。针对某一针对某一基因的三条以上探针呈阳性时，可定性的判定基因的表达。基因的三条以上探针呈阳性时，可定性的判定基因的表达。而通过比较正常和异常样品杂交信号的差异，来检测不同样而通过比较正常和异常样品杂交信号的差异，来检测不同样品中基因表达水平的变化。品中基因表达水平的变化。 探针设计原则：探针设计原则：1 1）探针

30、序列应为特异性强和灵敏度高的寡核苷酸。）探针序列应为特异性强和灵敏度高的寡核苷酸。2 2）(G+C)%(G+C)%应在应在 4060% 4060% 。3 3）避免内部）避免内部“发卡发卡”结构结构 ( (连续互补连续互补 4 nt 4 nt）。）。4 4）避免同一碱基的连续出现）避免同一碱基的连续出现( 4 nt)( 4 nt)。5 5）探针与其他已知的各种基因序列进行同源性比较，若此）探针与其他已知的各种基因序列进行同源性比较，若此探针序列与非靶基因序列有探针序列与非靶基因序列有70%70%以上的同源性或连续以上的同源性或连续8 8个个以上的碱基序列相同，则最好不用。以上的碱基序列相同，则最

31、好不用。6 6）设置多个序列相近的参考寡核苷酸探针来检测同一基因。）设置多个序列相近的参考寡核苷酸探针来检测同一基因。2. 基因功能分析研究基因功能分析研究 将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同情况细胞的上，对来源于不同情况细胞的mRNAmRNA或逆转录所得的或逆转录所得的cDNAcDNA进行检进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性等进行综合评定与判断。段特异性、分化阶段特异性等进行综合评定与判断。3. 疾病的基因诊断疾病的基因诊断目前诊