大肠杆菌感受态细胞制备及转化ppt课件

1、大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞制备及转化制备及转化 掌握制备和保管大肠杆菌感受态细胞的掌握制备和保管大肠杆菌感受态细胞的方法方法 掌握转化的方法技术掌握转化的方法技术 了解转化过程中各要素对转化率的影响了解转化过程中各要素对转化率的影响定义感受态Competence)：细菌处于容易吸收外源DNA 的形状转化transformation)：异源DNA分子导入受体细胞的过程致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作 在生长周期的任何时辰自动产生感受态；在生长周期的任何时辰自动产生感受态；e.g. 枯草杆菌枯草杆菌 在生长周期的特定时辰产生感受态；在生长周期的特定时辰产生感受态；e.g .

2、大肠杆菌大肠杆菌细菌产生感受态的类型细菌产生感受态的类型u受体菌：受体菌： u E.Coli DH5 E.Coli DH5：无：无ApAp抗性抗性u外源质粒外源质粒u Ampr Ampr抗性基因编码一种周质酶抗性基因编码一种周质酶-内酰内酰胺酶可特异地切割胺酶可特异地切割AmpAmp的的-内酰胺环，从内酰胺环，从而使其失去杀菌才干而使其失去杀菌才干 u选择选择: :u 如进展蓝白斑挑选时可选用如进展蓝白斑挑选时可选用DH5 DH5 、JM109 JM109 、 TG1 TG1 ；u 用用T7T7启动子进展原核表达时可选用启动子进展原核表达时可选用BL21(DE3)BL21(DE3)； 原生质体

3、法 电击法 特殊试剂诱导法：CaCl2诱导法u +质粒DNA420C热击复苏Amp+细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA构成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞外表,经短时间420C热击处置,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放在非选择性培育基上保温一段时间，使抗氨苄青霉素的表型表达后再转到含氨苄青霉素的选择性培育基上，长出来的菌即为转入了外源基因的菌株。公式：公式：转化子数转化子数/ug DNA = 单菌落数单菌落数 质粒浓度质粒浓度(ng/ul) X 1uL2.5ng/uL X10 x1000p细菌的生长形状：大肠杆菌在对数中期易产生感受态细菌的生长形状：

4、大肠杆菌在对数中期易产生感受态p OD OD值：值：0.30.30.5 (5X1070.5 (5X107个个/ml)/ml)p试剂的质量：试剂的质量：p 化合物及无机离子：化合物及无机离子：Rb+Rb+、Mn+Mn+、二甲亚砜等、二甲亚砜等p质粒：大小、构型质粒：大小、构型p外源外源DNADNA质粒与细胞的比例：质粒与细胞的比例：p器皿的干净度器皿的干净度p污染污染尽量一切翻开器皿盖的操作都在超净台中进展尽量一切翻开器皿盖的操作都在超净台中进展感受态细胞的保管 制备好的感受态细胞每100uL分装一支EP管 悄然混匀-可以用tip头悄然搅匀. 4保管不加甘油，可保管一周； 加30%甘油，-20

5、保管，可保管一月； 加30%甘油， 80 保管，可保管六月；实验器材 摇床 分光光度计 冷冻离心机 超净任务台 恒温水浴 涂布棒 恒温培育箱实验试剂 LB液体培育基 LB固体培育基 氨苄青霉素 0.1 M CaCl2 30% 甘油实验流程1、接单菌落到5ml LB液体培育基中，370C、190rpm振荡培育过夜2、5%250 ul) 菌液接种到含5 ml LB的试管中， 370C振荡培育1-2小时，至OD600 0.4-0.5 已完成3、将1.5mL菌液转移到离心管中4、离心 5000rpm ，40C，5min5、倒出培育液6. 用冰预冷的用冰预冷的1mL0.1M的的CaCl2 处置、悬浮细处

6、置、悬浮细 胞，胞，7 . 冰上冰上20min8. (取取1.5mL)5000rpm离心离心5min，倾去上清，倾去上清9. 100uL CaCl2悄然悬浮，冰浴悄然悬浮，冰浴大肠杆菌大肠杆菌DH5感受态的制备感受态的制备实验流程大肠杆菌DH5受态的制备-1 ml-20 min实验流程 1.1.实验样品实验样品: : 汲取汲取50uL 50uL 感受态细胞到另一个感受态细胞到另一个1.5 ml EP1.5 ml EP管中，参与管中，参与1uL 1uL 质粒枪头悄然混质粒枪头悄然混匀，勿吹匀，勿吹 打打 2. 2.阴性对照：阴性对照： DH5 DH5 感受态细胞感受态细胞50uL50uL 冰浴冰

7、浴20mins20mins 42 9042 90秒静置，勿摇动秒静置，勿摇动 迅速放到冰上迅速放到冰上, ,冰浴冰浴2mins2mins 参与参与950uL LB950uL LB培育基，标明组号，培育基，标明组号，37 37 200rpm 200rpm 摇床培育摇床培育 45 mins 45 mins 制备制备LB琼脂平板琼脂平板(已完成已完成) 含含Ap的的LB固体培育基倒平板固体培育基倒平板, 每组每组5个个. 编号编号1,2,3,4,5 不含不含Ap的的LB固体培育基平板。编号固体培育基平板。编号6涂布涂布 样品样品(转化培育后的菌液转化培育后的菌液),涂布于涂布于1,2,3,4,5号平板，各号平板，各100uL。 阴性对照阴性对照(转化培育后的菌液转化培育后的菌液) 100uL ：涂布于：涂布于6号平板。号平板。 静置静置15mins, 倒置平板倒置平板37 培育过夜培育过夜 涂布棒的运用 酒精灯的运用 运用前，浸入75%酒精中； 在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精不要烧到手； 等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却； 涂布均匀； 将涂布棒重新除菌以备下一次运用。察看结果明天上午察看结果明天上午 预期实验结果： 1-4号平板上出假设干单菌落，阐明？ 5号平板上没有可见菌落，阐明？ 6号平板上出现大量菌落，阐明？ 计数单菌落,计算转化率.p 如阴性对照中长出菌，能够缘由