《多酚氧化酶》ppt课件

1、第第10章章多酚氧化酶多酚氧化酶一、多酚氧化酶的一、多酚氧化酶的名称和自然界的分布名称和自然界的分布n多酚氧化酶多酚氧化酶1,2-1,2-苯二酚苯二酚: :氧氧 氧化复原酶氧化复原酶,EC 1.10.3.1,EC 1.10.3.1 一类含铜的一类含铜的氧化复原酶氧化复原酶，催化邻，催化邻-苯二酚氧化成邻苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能作苯二醌，也能作用于单酚单加氧酶的底物。用于单酚单加氧酶的底物。 n多酚氧化酶的共同特征是可以通过分子氧氧化酚或多酚多酚氧化酶的共同特征是可以通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚氧化

2、酶单酚氧化酶酪氨酸酶酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1、双酚氧化酶双酚氧化酶儿茶酚氧化酶儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2和和漆酶漆酶对苯二酚氧化酶对苯二酚氧化酶 laccase,EC.1.10.3.1。n在这三大类多酚氧化酶中，在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。1 1、多酚氧化酶的名称、多酚氧化酶的名称2、植物中多酚氧化酶分布、植物中多酚氧化酶分布n多酚氧化酶是植物中最受注意的一种酶多酚氧化酶是植物中最受注意的一种

3、酶, ,在葡萄在葡萄, ,洋李洋李, ,无花果无花果, ,枣枣, ,茶叶和咖啡豆中含量很高茶叶和咖啡豆中含量很高, ,它在它在这些果实中起着人们这些果实中起着人们期望期望的作用的作用. .n多酚氧化酶在桃多酚氧化酶在桃, ,苹果苹果, ,香蕉香蕉, ,荔枝荔枝, ,马铃薯马铃薯, ,莲藕莲藕和莴苣中的含量也是相当高和莴苣中的含量也是相当高, ,然而它对这些果实然而它对这些果实起着起着不需宜不需宜的作用的作用, ,易引起易引起褐变褐变, ,造成造成变质变质和和腐烂腐烂, ,对于新颖果实的对于新颖果实的保藏带来极大困难保藏带来极大困难n胡椒中不存在多酚氧化酶胡椒中不存在多酚氧化酶. . n存在存在

4、: :植物、果蔬的叶绿体、线粒体植物、果蔬的叶绿体、线粒体, ,马铃薯马铃薯块茎分布广泛块茎分布广泛n多酚氧化酶在植物中的含量随多酚氧化酶在植物中的含量随品种品种不同而有很大不同而有很大变化，在众多的水果和蔬菜中，变化，在众多的水果和蔬菜中，橄榄中的多酚氧橄榄中的多酚氧化酶活力最高化酶活力最高。n多酚氧化酶的活力分布还取决于果蔬的多酚氧化酶的活力分布还取决于果蔬的成熟度成熟度。在绿叶中，很大一部分酶活力集中在叶绿体中，在绿叶中，很大一部分酶活力集中在叶绿体中，在马铃薯块茎中，几乎集中在亚细胞中；在新采在马铃薯块茎中，几乎集中在亚细胞中；在新采收的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体收的苹果中

5、，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。和线粒体中。n果蔬中不同的果蔬中不同的部位部位的多酚氧化酶含量差异很大，的多酚氧化酶含量差异很大，例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。二、多酚氧化酶催化反响二、多酚氧化酶催化反响 及其作用底物及其作用底物n1.催化反响n多酚氧化酶是一种加氧酶，它催化酚的选择性羟基化，羟基化产物继续氧化生成邻-苯醌。n多酚氧化酶的作用下氧化形成不稳定的邻-苯醌类化合物,然后再进一步通过非酶氧化反响,聚合成黑色素melanin。羟基化羟基化氧化反应氧化反应多酚氧化酶多酚氧化酶R= H-, Me-, MeO-, HO2C-(CH2)2-, HO

6、CH2-, HO(CH2)2-, PhCONHCH2-H2O有机溶剂维生素 C聚合物OHROHROHO2 H2OO2 H2OOORn多酚氧化酶的作用导致香蕉,苹果,桃,马铃薯,蘑菇,虾发生非需宜的褐变和人的黑斑形成n然而对茶叶,咖啡,葡萄干和梅干,以及人的皮肤色素形成产生需宜的褐变n当邻苯醌与蛋白质中赖氨酸残基的-氨基反响,可引起蛋白质的和下降,同样由于褐变反响也将会造成食品的和的变化。n热带水果热带水果50%50%以上的损失都是由于以上的损失都是由于酶促褐变酶促褐变引起的引起的. .同时酶促褐变也是造成同时酶促褐变也是造成新颖蔬菜新颖蔬菜例如莴苣和果汁例如莴苣和果汁的颜色变化的颜色变化, ,

7、营养和口感变劣的主要原因营养和口感变劣的主要原因n控制控制果蔬加工和贮藏过程中果蔬加工和贮藏过程中酶促褐变酶促褐变, ,n例如例如驱除驱除OO2 2和底物酚类化合物和底物酚类化合物以防止褐变以防止褐变, ,或者添加抗或者添加抗坏血酸坏血酸, ,亚硫酸氢钠和硫醇类化合物等亚硫酸氢钠和硫醇类化合物等, ,将初始产物将初始产物, ,邻苯邻苯醌复原为原来的底物醌复原为原来的底物, ,从而阻止黑色素的生成从而阻止黑色素的生成. .n复原剂复原剂都能直接引起都能直接引起酶失活酶失活, ,从而抑制酶促褐变从而抑制酶促褐变. .这是因这是因为抗坏血酸可以破坏酶活性位点上的组氨酸残基为抗坏血酸可以破坏酶活性位点

8、上的组氨酸残基, ,而亚而亚硫酸氢钠和硫醇可以除去酶活性位点中的硫酸氢钠和硫醇可以除去酶活性位点中的CuCu2+2+n4-4-己基间苯二酚己基间苯二酚, ,苯甲酸苯甲酸和其他一些和其他一些非底物酚类化合物非底物酚类化合物, ,也可作为多酚氧化酶的有效也可作为多酚氧化酶的有效竞争性抑制剂竞争性抑制剂2.作用底物作用底物n水果、蔬菜中底物为：水果、蔬菜中底物为： n一元酚类一元酚类 n邻二酚类对位二酚也可邻二酚类对位二酚也可 间位二酚不作底物间位二酚不作底物 如：如： 水果中的儿茶酚水果中的儿茶酚 OH OH 土豆中的酪氨酸土豆中的酪氨酸 HO CH2CHCOOH NH2n重要的天然底物三、三、p

9、H和温度对多酚和温度对多酚 氧化酶活力影响氧化酶活力影响1.pH1.pH对酶活力的影响对酶活力的影响1 1适宜适宜pHpH：4 47 7 2 2不同种类，甚至同一种果蔬中的不同品种得到的不同种类，甚至同一种果蔬中的不同品种得到的多酚氧化酶，也有不同的最适多酚氧化酶，也有不同的最适pHpH3 3果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶, ,最适最适pHpH也有差也有差异异4 4酶的提取或别离的方法对它的最适酶的提取或别离的方法对它的最适pHpH也有影响也有影响5 5测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最适测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最适pHpH也有影响也有影响6

10、6大多数多酚氧化酶只有一个最适大多数多酚氧化酶只有一个最适pH,pH,在一些情况下在一些情况下, , 有第二个最适有第二个最适pHpH2.温度对多酚氧化酶活力影响温度对多酚氧化酶活力影响n不同种类、品种、部位的不同种类、品种、部位的多酚氧化酶有多酚氧化酶有不同的热稳定性，不同的热稳定性，通常最适温度在常温通常最适温度在常温n加热易使酶失活加热易使酶失活n同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同的热稳定性有不同的热稳定性n低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降，低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降，但活性下降比较缓慢但活性下降比较缓慢四、多酚氧化酶的激活剂、抑

11、制剂四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂 和果蔬酶促褐变的防止和果蔬酶促褐变的防止n1.1.激活剂激活剂n多酚氧化酶的活性形式是含铜的酶单体多酚氧化酶的活性形式是含铜的酶单体的寡聚体，激活剂的作用是的寡聚体，激活剂的作用是使酶蛋白以使酶蛋白以一定的聚合度存在一定的聚合度存在，才有生物活性。，才有生物活性。nSDSSDS、 CuCu2+2+ 、酸、尿素等、酸、尿素等2.抑制剂和果蔬酶促褐变的防止抑制剂和果蔬酶促褐变的防止n酶促褐变酶促褐变: :较浅色的水果、蔬菜在受到较浅色的水果、蔬菜在受到机机械性损伤械性损伤削皮、切片、压伤、虫咬、削皮、切片、压伤、虫咬、磨浆、捣碎及处于磨浆、捣碎及处于异常环境变化

12、异常环境变化受受冻、受热等，在酶促催化下氧化冻、受热等，在酶促催化下氧化而呈褐色，称为酶促褐变而呈褐色，称为酶促褐变n亚硫酸类是酚酶抑制剂。亚硫酸类是酚酶抑制剂。实例实例1：土豆的褐变：土豆的褐变实例实例2：含有：含有儿茶酚儿茶酚水果的褐变水果的褐变褐变防止方法褐变防止方法酶促褐变的酶促褐变的三个条件三个条件，缺一不可。，缺一不可。 即：多酚类物质、酚酶、氧气即：多酚类物质、酚酶、氧气 除去多酚类物质困难，不现实。除去多酚类物质困难，不现实。 一般为一般为 降低酚酶活性、驱氧降低酚酶活性、驱氧 1加热钝化酶活性加热钝化酶活性n7595、57S的加热处理，可使大部分的加热处理，可使大部分酶活性丧

13、失。酶活性丧失。常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌 加工中，必须严格控制时间和温度。加工中，必须严格控制时间和温度。加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐变，加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐变，但会影响食品品质；加热缺乏，不能抑制酶褐但会影响食品品质；加热缺乏，不能抑制酶褐变。变。微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响风微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响风味。味。2螯合酶促作用的金属离螯合酶促作用的金属离子子n金属铁、铜、锡、铝等离子是多酚氧化酶金属铁、铜、锡、铝等离子是多酚氧化酶的激活剂。的激活剂。Fe3+、Fe2+、Cu2+能促进褐变主能促进褐变主要是因为铁

14、和铜不仅能和酚类化合物反响形成要是因为铁和铜不仅能和酚类化合物反响形成褐色物质，而且能催化复原酮类的氧化。褐色物质，而且能催化复原酮类的氧化。n柠檬酸对柠檬酸对Cu2+有螯合作用。有螯合作用。nEDTA是一种金属离子螯合剂，可阻止金属离是一种金属离子螯合剂，可阻止金属离子对褐变反响的促进作用，但其与作用对象有子对褐变反响的促进作用，但其与作用对象有关，有的效果那么不明显。关，有的效果那么不明显。 3酸处理法酸处理法n多数酚酶最适多数酚酶最适pH67，pH 3失活失活高酸性环境高酸性环境会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致PPO逐渐失活，逐渐失活，酶活性趋于最低。

15、酶活性趋于最低。n常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混合酸。合酸。n柠檬酸可降低柠檬酸可降低pH，还可络合酚酶辅基，还可络合酚酶辅基Cu2+，但单独用但单独用效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。 n理论证明：理论证明：0.5%0.5%柠檬酸柠檬酸 + 0.3%+ 0.3%抗坏血酸抗坏血酸效果好。效果好。n抗坏血酸不但能降低体系抗坏血酸不但能降低体系pH，而且具有复原剂的作用，而且具有复原剂的作用，可将体系中的醌类及其衍生物复原成酚，并通过自身可将体系中的醌类及其衍生物复原成酚，并通过自身氧化来减少体系的

16、含氧量。氧化来减少体系的含氧量。 抗坏血酸抑制酶褐变的机理图抗坏血酸抑制酶褐变的机理图4酶活抑制剂酶活抑制剂亚硫酸类是酚酶抑制剂。亚硫酸类是酚酶抑制剂。 常用的有：二氧化硫、亚硫酸钠、常用的有：二氧化硫、亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、 焦亚硫酸钠、低亚硫酸钠焦亚硫酸钠、低亚硫酸钠Na2 S 2 O 4 如：如：在蘑菇、马铃薯、桃、苹果等加工中，常在蘑菇、马铃薯、桃、苹果等加工中，常用二氧化硫及亚硫酸盐类作护色剂。用二氧化硫及亚硫酸盐类作护色剂。 实验说明：实验说明：10ppm可抑制酚酶活性，但有挥发可抑制酚酶活性，但有挥发损失，还与醛类加成等。实际应用损失，还与醛类加成等。实际应用300

17、ppm，残，残留留 20 ppm。 在微酸性在微酸性pH6时，抑制酚酶的效果最好。时，抑制酚酶的效果最好。 防止原因有三防止原因有三： a.a.抑制酶活性抑制酶活性b.b.将醌复原为酚将醌复原为酚 c.c.与醌加成，防止聚合与醌加成，防止聚合5驱氧驱氧n通过沸水烫漂、抽真空通过沸水烫漂、抽真空93kPa，515min、高浓度抗坏血酸溶液浸泡、气调包、高浓度抗坏血酸溶液浸泡、气调包装设计等均可到达驱除食品内氧气的目的，从装设计等均可到达驱除食品内氧气的目的，从而抑制酶褐变的发生。而抑制酶褐变的发生。n控制氧气含量用抽空处理技术或添加去氧剂等控制氧气含量用抽空处理技术或添加去氧剂等方法：用方法：用

18、2%食盐食盐+0.2%柠檬酸柠檬酸+0.06%侧侧重亚硫酸钠溶液作抽空液，在重亚硫酸钠溶液作抽空液，在500mmHg的真的真空度抽空空度抽空510min,可获得良好的护色效果。可获得良好的护色效果。 褐变的利用褐变的利用期望的褐变期望的褐变苹果酒、红茶发酵生成茶红素、可可苹果酒、红茶发酵生成茶红素、可可粉、葡萄干、梅干、椰枣、无花果。粉、葡萄干、梅干、椰枣、无花果。红茶是全发酵茶，茶中的多酚物质主要是红茶是全发酵茶，茶中的多酚物质主要是儿茶素经多酚氧化酶与过氧化物酶的作用，儿茶素经多酚氧化酶与过氧化物酶的作用，氧化并聚合生成茶色素。氧化并聚合生成茶色素。红茶中含有三种酚性色素红茶中含有三种酚性

19、色素茶红素、茶茶红素、茶黄素和黄酮醇甙。黄素和黄酮醇甙。五、多五、多酚酚氧化酶的分子形式氧化酶的分子形式n多酚氧化酶有多种分子形式多酚氧化酶有多种分子形式n原因：类似的亚基不同程度的聚合；原因：类似的亚基不同程度的聚合；不同亚基不同方式的结合不同亚基不同方式的结合; ;酶蛋白酶蛋白质构象的改变质构象的改变; ;前三种情况的结合。前三种情况的结合。n多酚氧化酶多种分子形式之间的差异表多酚氧化酶多种分子形式之间的差异表如今底物特异性、最适如今底物特异性、最适pHpH、温度稳定性、温度稳定性、对抑制剂敏感性、氧化和羟基化活力的对抑制剂敏感性、氧化和羟基化活力的差异。差异。六、多酚氧化酶活力测定六、多

20、酚氧化酶活力测定n多酚氧化酶活力的测定方法可以分为两多酚氧化酶活力的测定方法可以分为两类类n测定底物消失的速度测定底物消失的速度n测定产物生成的速度测定产物生成的速度 限于测定反响的初速度。限于测定反响的初速度。PPO活性测定活性测定n终点法终点法n多酚氧化酶多酚氧化酶催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌类反响，以儿茶酚为类反响，以儿茶酚为多酚氧化酶多酚氧化酶的的底物底物，其氧化，其氧化产物在产物在416nm416nm处有最大光吸收。处有最大光吸收。n测定系统测定系统：1.5ml 20mmol/L1.5ml 20mmol/L邻苯二酚溶于邻苯二酚溶于0.05mol/L

21、,pH6.8KH0.05mol/L,pH6.8KH2 2POPO4 4-NaOH-NaOH缓冲液中，然后再缓冲液中，然后再参加参加0.1ml0.1ml酶提取液，保温酶提取液，保温3737C C，三氯乙酸终止反，三氯乙酸终止反响，并响，并4000r/min4000r/min离心离心5min5min，取上清液，适当稀释。，取上清液，适当稀释。 以空白为对照，用分光光度计测定其在以空白为对照，用分光光度计测定其在416nm416nm波长波长下的下的O.DO.D值。值。 n酶活性单位酶活性单位为在测定条件下，每分钟引起吸光度为在测定条件下，每分钟引起吸光度改变改变0.010.01所需的酶量所需的酶量动

22、态法动态法 PPOPPO活性的测定活性的测定n取取0.05mol/L,pH6.8KH0.05mol/L,pH6.8KH2 2POPO4 4-NaOH-NaOH缓冲液缓冲液1.5ml1.5ml于于1cm1cm比色皿中，参加比色皿中，参加1ml 20mmol/L1ml 20mmol/L邻苯二酚溶液，邻苯二酚溶液，PPOPPO酶液酶液0.5ml0.5ml，混匀后在，混匀后在416nm416nm处比色，酶液参加后开场记时，每处比色，酶液参加后开场记时，每30s30s记录一次记录一次OD OD 随时间的变化值，以最初随时间的变化值，以最初直线段的斜率直线段的斜率OD/tOD/t计算酶活力。计算酶活力。n

23、一个一个酶活力单位酶活力单位定义定义为：在测定条件下，为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变每分钟引起吸光度改变0.010.01所需的酶量。所需的酶量。七、水果和蔬菜中的七、水果和蔬菜中的 多酚氧化酶及其底物多酚氧化酶及其底物n正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与PPOPPO酶存在于不同部位。这种分布是通过一系列酶存在于不同部位。这种分布是通过一系列膜系统实现的，受膜系统实现的，受膜屏障的作用膜屏障的作用，这种区域性的，这种区域性的分布阻止了底物和酶的互相接触，所以正常组织分布阻止了底物和酶的互相接触，所以正常组织是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物

24、质的区是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物质的区域化分布破坏，域化分布破坏，PPOPPO与酚类物质接近并与其发生与酚类物质接近并与其发生化学作用，这将导致褐变。化学作用，这将导致褐变。n水果水果有更大的有着有更大的有着较弱薄片成分的细胞较弱薄片成分的细胞，冷藏时，冷藏时易发生易发生细胞壁破裂细胞壁破裂，使，使PPOPPO与酚类物质接触，产与酚类物质接触，产生褐变。生褐变。1.苹果中多酚氧化酶n引起苹果褐变的重要原因之一引起苹果褐变的重要原因之一n未成熟的苹果比成熟的更易褐变未成熟的苹果比成熟的更易褐变n在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期间是增加的间是增加的2.梨中的多酚氧化酶n梨多酚氧化酶梨多酚氧化酶仅作用于仅作用于邻苯酚邻苯酚, ,与与对苯酚对苯酚、间苯酚间苯酚和和一元酚一元酚无作用无作用n以儿茶酚为以儿茶酚为底物底物, ,该酶的最适该酶的最适pHpH为为6.5,6.5,在在3030活性最强活性最强. . n亚硫酸氢钠、维生素亚硫酸氢钠、维生素C C、柠檬酸对梨中多、柠檬酸对梨中多酚氧化酶的抑制作用依次减弱酚氧化酶的抑制作用依次减弱, ,硫酸钠几硫酸钠几乎无抑制作用乎无抑制作用n不同底物和同底物不同浓度影响多酚氧不同底物和同底物不同浓度影响多酚氧化酶特性化酶特性.