斑点叉尾天然单链ScFv噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

1、-论文发表专家-中国掌木期刊网.qikanwangPnel斑点叉尾天然单链（ScFv）噬菌体抗体库的构建及初步鉴定摘要：以健康未经免疫的斑点叉尾为试验材料，取其新鲜外周血，分离淋巴细胞，提取总rna,逆转录合成cdna。per扩增重链fd和轻链cdna,以纯化的vh、v1基因为模板,以与vh基因3'端和v1基因一5'端序列互补的linker-primermix为引物，将vh、v1随机拼接为scfv。通过酶切连接，依次将pcr产物插入质粒p3mh相应位点，热激法转化大肠杆菌x11-b1ue,加入辅助噬菌体vcsm13,构建噬菌体单链抗体库。测定库容并酶切鉴定。斑点叉尾天然单链（s

2、cfV）噬菌体抗体库成功构建为进一步筛选特异性抗体及从斑点叉尾病变组织中提取特异性抗原用于免疫治疗奠定了基础。关键词：斑点叉尾；抗体库；噬菌体展示；抗体单链（scfconstructionandpreliminaryidentificationof,ietaluruspunetaussingle-chainantibolylibraryofnaturalphageinchannelcatfishwanghui1,zoushi-ping2(1.collegeoffisheries,huazhongagriculturaluniversity,wuhan430070,china;2.yangtze

3、riverfisheriesreserchinstitute,chineseacademyoffisherysciences,wuhan430223,china)-论文发表专家-：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnelabstract:peripheralblood1mphocyteswereisolatedfrom250mlblood,whichwasobtainedfrom50nonimmunnizedhealthychannelcatfishthroughtheirvenacaudalis.theheavychainfdandlightchaincdnasynthe

4、sizedfromthetotalrnaoflymphocyteswereperamplifiedandtheamplificationproductswerecompactedby1inkerprimermixintosefv.thentheamplificationproductswereligatedsuecessivelyintothephagemidvectorp3mh,thentheligatedsampiewastransformedintocompetente.colixllblue.thetransformedcellswereinfectedwithvesm13helper

5、phagetoyieldrecombinantphagescfvantibody.thesuccessfulconstructionofnaivechannelcatfishphag-论文发表专家-eantibody：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnellibrarycreatedfavourableconditionsforselectingspecificphageantibodyandabstractingspecificantigen.keywords:ictaluruspunctatusrafinesque;antibodylibrary;bacterialp

6、hage;scfv斑点叉尾(ictaluruspunctatusrafinesque)亦称沟(channelcatfish),属于鱼念形目(siluriformes)科(ieta1uridae)鱼类。主要分布于美国中部、加拿大南部和大西洋沿岸的部分地区。斑点叉尾是水产养殖业中最为重要的养殖鱼种之一，自20世纪80年代引进我国以来养殖规模不断扩大，出口量也在逐年上升。但是由于斑点叉尾种质资源退化严重，养殖技术较低，养殖环境恶化等原因，导致人工养殖的斑点叉尾病害频发，给养殖业带来巨大损失。斑点叉尾疾病防治应当坚持“预防为主,防重于治”的原则。噬菌体抗体是指采用基因克隆技术将b细胞全套可变区基因克隆

7、出来，通过与噬菌体衣壳蛋白基因连接，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的抗体分子。用b淋巴细胞全套抗体可变区基因克隆并组装成的噬菌体群体称为噬菌体抗体库1。该技术克服了单克隆抗体杂交瘤细胞中抗体不稳定、容易丢失的弊端，直接利用抗-论文发表专家-中国掌木期刊网.qikanwangPnel原从抗体库中筛选特异性抗体2-4。本实验室采用未经免疫的健康斑点叉尾外周血单个核细胞（pbme）为基因来源，建立斑点叉尾天然单链（scfV）噬菌体抗体库。构建的主要目的是为后期筛选抗原特异性抗体打下基础，筛选出的抗体主要用于斑点叉尾疾病早期的抗体诊断试剂盒，从而更有效地对斑点叉尾疾病进行防治。1材料与方法1.1材料

8、淋巴细胞分离液购自上海超研生物科技有限公司；rna提取纯化试剂Jtrizol（bioflux）、逆转录试剂盒、taqdna聚合酶、dntp购自takara公司；t4dna连接酶购自promega公司；限制性内切酶spei、xhoi、saci、xbai、pmdl8tsimplevector载体及试验所用培养基均购自北京盈信阳光生物技术有限公司；dna凝胶回收试剂盒，质粒纯化试剂盒均购自鼎国生物公司。宿主菌x11b1ue,由本实验室保存；辅助噬菌体vcsm13,来自武汉生物制品研究所；载体p3mh,由海军总医院王琰教授惠赠，由本实验室保存。引物序列：pl(vhfor):5'cggagctc

9、acaccagggggaaatcgtc-3-论文发表专家-gaaacagtcac：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnelagagactggcgagctctctgctagagacaccaccttgttcctcp5(vhftggggcggaggcggaggtetctctcactgacor1inkegggaccggtteaggctctcca3'3rv1bacgtcaccggcggaggctegk):5'gtcggtggtggcattgag1）淋巴细胞的提取和纯化。通过尾静脉从未经免疫的多条斑点叉尾抽取外周静脉血共250ml,常规方法分离pbmc。洗涤计数后，每1

10、07个细胞加1mltrizo1提取总rna,经异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后溶于1g/1depc水中，取适量做琼脂糖凝胶电泳，鉴定rna质量，并用紫外分光光度计测定rna浓度，其余保存于70-论文发表专家-：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnel2）逆转录cdna和pcr扩增vh段及v1链基因。以o1igodt20为引物，按照takara产品说明书，将rna逆转录为cdna。分别用轻链v1,重链vh引物（pl、p2、p3、p5）进行pcr扩增。95C预变性5min;94c30s,64C（不同引物组合退火温度不同，波动于55-65C之间）30s,72c50s,3035个循环；

11、72C延伸10min。3）以纯化的vh、v1基因为模板，以与vh基因3'端和vl基因5'端序列互补的p5为引物，进行重叠延伸反应，4抹120mmol/1的mgcl2,5110Xmmol/ldntp,0.5plbsa（10mg/ml）,2plcdna,28.5pl去离子水，总体积50pl,反应条件为94C1min,63C4min,共7个循环，将vh、v1随机拼接为单链（scfv）。4）单链（scfv）pcr产物经过电泳，回收，纯化，连接t载体，然后转化x11blue,提取质粒后，经saci和xbai双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。将表达载体p3mh用同样的两个酶进行酶切，

12、用1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，再与已经回收的轻链片断进行连接反应（pcr产物0.45pg,线性载体1.4wg）,4C连接过夜。次日加入200w1超级感受态x11b1ue,进行热激转化（冰浴30min,42C热激90s,冰浴12min）。转化反应结-论文发表专家-束后立即加入800pg预热到37：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnelC的soc培养基，37C,200r/min振荡1h。加入10mlsoc培amp）。取部养基（含50mg/1tet和25mg/1分菌液铺1b-amp琼脂平板，计算库容5）上述菌液加入socamp培养液振荡1h后，加入辅助噬菌体vcsm13约1

13、012pfu,混匀后加入50mlsob培养基，继续振荡培养2h,之后加入kana至70mg/1,37C振荡过夜。次日4C,4000r/min离心15min,得到上清液，加入聚乙二醇8000及nac1使两者的终浓度为40g/1和30g/1。振荡促溶，冰浴30min,9000r/min离心20min,4C。弃上清液，用2ml10g/1bsapbs悬浮噬菌体沉淀，14000r/min离心5min,除去残留的细菌碎片。收集上清液，加入nan3至0.2g/1,4C保存。至此，用dna重组的方法，将单链基因（scfv）组合到了噬粒载体，即为scfv噬菌体表面呈现文库。6 ）将适量ovasmp、ovasmz

14、分别溶解于0.1mo1/1ph9.6的碳酸盐缓冲液中，包被无菌e1isa板，100ii1/孔，置于无菌小湿盒4C过夜。次日用pbst洗板3次后用5%bsapbs37C封闭2h,弃封闭液，同上洗涤，干燥备用。7 ）取等体积1%ova-pbs与库菌液混合，37C孵育-论文发表专家-：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnel30min。取包被孔2孔，加入上述混合液1001/孔,37C孵育2h;同时接种10111大肠杆菌x11b1ue于10ml1b中，37C220r/min振荡培养至对数生长期。弃去孔中的液体，用150w1/孔pbst(0.1%tween-20)洗涤，过程中用移液器

15、反复吹打，重复洗涤5次，每次5min。然后加入1001孔甘氨酸盐酸洗脱液(ph2.2),37C孵育30min,再加入71/孔2mo1/1tris中和，之后将液体转移到10m1无菌离心管中，加入2m1新鲜制备的大肠杆菌x11-b1ue,37C孵育30min,分别取10pl、lpl、0.1p1涂1bat平板(amp50p1/m1,tet101/m1),37C培养过夜，计数菌落数，测定转化率。其余菌液全部转入10ml1b培养液(tet10pg/ml)中，加入5plamp,37c振荡培养1h,再加入5plamp,继续振荡培养1h,然后再转入100ml1b培养液(amp5010pg/ml)中继续培养2h

16、,加入约1012pfu辅助噬菌体vcsm13,37C继续培养2h,再加入卡那霉素终浓度至70g/ml,37C180r/min振荡培养过夜。4c,4000r/min离心15min,收集上清液，加入4gpeg8000和3gnac1,37C摇床促溶5min后冰浴30min,4C8000r/min离心30min,弃上清液，倒置-论文发表专家-离心管10min沥干残液，加入3：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnelml含l%bsa的tbs重悬沉淀，4C12000r/min离心5min,收集上清液即为次级SCfV噬菌体抗体库。每一轮筛选后均测定次级库的滴度并计算噬菌体投入/产出比（回

17、收率），作为特异性噬菌体抗体富集的指标。8）单克隆噬菌体抗体的制备。将获得的单个噬菌体克隆转染新鲜制备的大肠杆菌xllblue,铺1b平板（amp50pg/ml,tet10pg/ml）,37C培养过夜。挑取30个单菌落，分别接种到2ml1b培养基中（amp50g/ml,tet10pg/ml）,37C振荡培养至对数生长期，加入5011vcsm13,37C振荡培养2h,之后加入卡那霉素至终浓度70wg/m1,30C振荡培养过夜。4C,12000r/min离心10min,收集上清液即为单抗。9）噬菌体单抗的e1isa鉴定。用e1isa法进行抗体特异性结合性能的鉴定：分别用ovasmp、ovasmz包

18、被酶标板，3%bsa-pbs封闭，之后将上步中单抗用1%bsa-pbs稀释1倍加入到酶标板中37C孵育2h,同时设空白、vcsml3、ova做阴性对照。2结果2.1 总rna提取由图1可见，甲醛变性电泳显示rna条带清晰，28s、18-论文发表专家-：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnels亮度之比约为2：1,并且可以见到微弱的5s条带（图1）。测定a值1.8,说明rna无降解，无蛋白污染，可以作为模板进行逆转录。2.2逆转录生成cdnacdna第一i链电泳显本cdna为从2502500bp弥漫性分布的条带。用设计的18s引物做内参，扩增后可见明显18s条带，证明cdna

19、性质良好。2.4pcr扩增重链vh段和轻链v1段扩增的重链vh段和轻链v1段产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在650bp左右可见较亮特异性条带。2.5通过1inker连接重链vh段和轻链v1段成单链（scfv）基因连接重链vh段和轻链v1段成单链（scfv）段产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在1400bp左右可见较亮特异性条带。2.6单链（scfv）噬菌体抗体的构建及鉴定切下1400bp左右条带回收后连接t载体，将kt链、入一t链合并与p3mh分别用saci和xbai双酶切，琼脂糖凝胶电泳可见约1400bp和4000bp大小的单一条带，为所需的载体和目的片段。回收后将二者连接，电转化，摇-论文发表专家

20、-：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnel菌扩增，提取质粒dna,用saci和xbai双酶切后电泳,显示出约4000bp和约1400bp的两条带，说明单链（scfv）库构建成功。所获得的轻连库的库容为5.1X107o对随机挑选的20个单菌落进行菌液pcr,其中18个可以扩增出轻链片段，说明重组率为90%。2.7噬菌体抗体库的构建及鉴定经过提取抗体库质粒dna,分别用xhoi和spei,saci和xbai双酶切后电泳，显示4100bp和1400bp左右条带；用xhoi单酶切，显示约5500bp大片段。以噬菌体抗体库噬粒dna为模板，以单链（scfv）引物组合进行pcr,扩增

21、出约1400bp的插入片段，说明构建抗体库成功。抗体库进行了4次构建，按照兰风华等5的方法计算库容分别为1.63X107、1.11X107、1.42X107、1.51X107,积累在一起总库容为5.67X107,单链（scfv）库的重组效率达到90%。2.8抗体的筛选分别用ovasmp、ovasmz为固相抗原对噬菌体抗体库进行5轮富集筛选。从表1、表2中可以看出，随着筛选轮数的增多，虽然抗原包被量在不断减少，洗脱次数不断增加，抗体的投入产出比仍不断升高，说明噬菌体抗体得到明显富集。2.7噬菌体抗体的e1isa检测-论文发表专家-：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnel挑取

22、单个克隆，小规模制备抗体后，ovasmp、ovasmz作为包被抗原，设空白、vcsml3、ova做阴性对照,对60个样进行平行检测，结果得到smp阳性菌株11个，smz阳性菌株9个，其余均为阴性。3讨论斑点叉尾是水产养殖中的重要经济鱼种，在其原产地美国的养殖规模达到水产养殖的60%以上。引进我国以来，养殖规模日益扩大，出口量也不断增加。此次试验我们选择斑点叉尾作为建库对象，不仅是因为它在水产养殖业中的重要地位，还在于它是硬骨鱼类免疫系统研究较为透彻的模式动物之一。作为硬骨鱼类的代表性鱼种，斑点叉尾的优势在于，目前已经积累了大量关于斑点叉尾免疫球蛋白结构和功能方面的生物学信息；已经建立起体外细胞

23、培养体系，可以利用此体系做抗原递呈，细胞融合及温度对免疫系统影响方面的试验；已经建立起特定类型的无性白细胞系包括b细胞、巨噬细胞、t细胞及nk细胞等6。选择未经免疫的斑点叉尾,分离外周血淋巴细胞，提取总rna,模拟具体内天然的抗体谱，构建大库容噬菌体抗体文库，为进一步筛选特异性抗体打下基础。噬菌体抗体库技术诞生以来，已经取得了巨大的成果，显示它的强大生命力。它不仅能够生产具有识别功能的特异性抗体，而且能够筛选和生产具有催化和切割功能的抗体酶，解决了杂交瘤系统低效及鼠单抗的动物源性难题，对于肿瘤、自身免疫性疾病和感染性-论文发表专家-：£0,：中国掌木期刊网.qikanwangPnel

24、疾病发病机理的研究、诊断、被动免疫和治疗有极为重要的试验价值。目前认为抗体引物的多样性与细菌转化率是影响抗体库容量的主要因素，而库容的大小与抗体亲和力大小成正比。为了获得亲和力高的抗体，本试验从50尾健康未经免疫的斑点叉尾外周血中分离出淋巴细胞抽提总rna,经15对特异性引物rt-pcr扩增出scfv抗体基因片段，制备超级感受态进行转化，经过四次转化构建的库容为5.67X107。如果要得到接近体内b淋巴细胞群数量（约108）的抗体库，必须通过增加转化次数来累积库容。据相关文献报道lobb等8通过上百次的电穿孔转化获得了1010的抗体库，接近体内经过人工免疫达到的抗体水平。接近体内经过人工免疫达到的抗体水平。在从自建的斑点叉尾天然单链（scfv）噬菌体抗体库中筛选得到抗磺胺类药物的鱼源单抗。试验中利用偶联卵血清蛋白的两种磺胺类药物包被固相，对自建的斑点叉尾天然单链（scfV）噬菌体抗体库进行筛选，在筛选过程中，抗原浓度呈半数递减，洗脱次数逐渐增加，以减少亲和力弱的抗体的结合。经过5轮的富集淘选，我们得到多株特异性良好的抗体，并证明了所构建的噬菌体抗体库具有良好的多样性。噬菌体抗体库技术的引入使针对性鱼源单抗的制备成为