医学细胞生物学-2015-第二次课

1、问题一问题一 下面的图片是在哪种显微镜下观察到的结果下面的图片是在哪种显微镜下观察到的结果问题三：如果想知道某一中蛋白质在细胞中的问题三：如果想知道某一中蛋白质在细胞中的分布和不同组织中表达量的差异，如何设计实分布和不同组织中表达量的差异，如何设计实验？验？问题二：细胞系培养过程中一般包括哪些环节？问题二：细胞系培养过程中一般包括哪些环节？第二章第二章 细胞生物学的研究方法细胞生物学的研究方法第一节第一节 显微镜技术显微镜技术第二节第二节 细胞的培养细胞的培养第三节第三节 细胞的分离和细胞组分的分离细胞的分离和细胞组分的分离第四节第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术细胞化学和细胞内分子示踪技术

2、第五节第五节 细胞功能基因组学研究技术细胞功能基因组学研究技术第六节第六节 生物大分子的结构测定生物大分子的结构测定第三节第三节 细胞的分离和细胞组分的分离细胞的分离和细胞组分的分离一一 细胞的分离细胞的分离1 利用物理和生物学特性可简单有效地分离利用物理和生物学特性可简单有效地分离和筛选细胞和筛选细胞 利用细胞的利用细胞的生长生长特性分离特性分离 利用细胞的利用细胞的密度密度特性分离特性分离 一一 细胞的分离细胞的分离2 免疫磁珠法可获得高纯度细胞免疫磁珠法可获得高纯度细胞 免疫磁珠免疫磁珠3 流式细胞术精确分选荧光标记的细胞流式细胞术精确分选荧光标记的细胞 流式细胞仪流式细胞仪 4 激光捕

3、获显微切割技术可从组织切片中精确分离激光捕获显微切割技术可从组织切片中精确分离单一细胞单一细胞 不能分离活细胞不能分离活细胞 ，精确分离单一细胞，精确分离单一细胞7从血液、体液中分离细胞血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞粒细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞B淋巴细胞淋巴细胞T淋巴细胞淋巴细胞（CD8+和和CD4+）8从血液中分离细胞采血方法：采血方法： 人人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血； 小动物（大鼠、小鼠）小动物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。断颈取血或

4、股动脉放血。 兔兔 耳静脉或动脉穿刺取血耳静脉或动脉穿刺取血。 9细胞分离技术-从血液中分离细胞血样中红细胞和白细胞的分离：血样中红细胞和白细胞的分离： 利用细胞的相对密度或大小不同利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理而沉降速度不同的原理，以自然沉降，以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。的细胞分离。 将抗凝血与将抗凝血与3%3%明胶（经灭菌消毒）明胶（经灭菌消毒）等量或等量或3 3l l量混合于离心管中，直立量混合于离心管中，直立静置静置30-60min30-60min，红细胞沉于管底，上，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。

5、层乳白色混浊液含白细胞。 10细胞分离技术细胞分离技术-从血液中分离细胞从血液中分离细胞血中单个核细胞的分离：血中单个核细胞的分离： 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在1.050-1.0771.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。之间，采用速度沉降法原理使其分离。 淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液12细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞血中单核细胞的分离：血中单核细胞的分离： 利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离单单个个核核细细

6、胞胞悬悬液液多将悬液放入多将悬液放入12cm12cm直径的培养直径的培养皿中，于皿中，于3737培养箱中静置培养箱中静置30-30-60min60min。此时单核细胞贴壁，而。此时单核细胞贴壁，而淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞，并用壁细胞，并用HanksHanks液轻轻冲洗液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下培养皿以尽量洗下未贴壁细胞未贴壁细胞（淋巴细胞）。（淋巴细胞）。 用用Hanks液强液强力冲洗吹打与力冲洗吹打与震荡，将贴壁震荡，将贴壁的单核细胞冲的单核细胞冲落或用刮刀轻落或用刮刀轻刮，收集刮，收集贴壁贴壁的单核细胞的单核细胞。 计数后计数后分别制分别制备所需备所需浓度

7、的浓度的细胞悬细胞悬液。液。13细胞分离技术-从血液中分离细胞免疫磁珠法免疫磁珠法(MACS)(MACS)分离分离T T、B B淋巴细胞：淋巴细胞： 磁性微珠是磁性微珠是2020世纪世纪8080年代初以高分子材料和金属离子年代初以高分子材料和金属离子（如（如FeFe3 3O O4 4）为原料聚合而成的一种以）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心金属离子为核心、外层、外层均匀地包裹均匀地包裹高分子聚合体高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在液相的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针

8、对某种细胞表面抗原的微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体特异性抗体即即可制成免疫磁性微珠。可制成免疫磁性微珠。 磁性氧化物核心（磁性氧化物核心（Fe3O4）聚合物层（聚苯乙烯或聚氯乙烯等高分子材料）聚合物层（聚苯乙烯或聚氯乙烯等高分子材料）15细胞分离技术-从血液中分离细胞 免疫磁性微珠用于细胞的免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、后

9、，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。分离的目的。 通常有通常有二种分离方式二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。得以分离。17细胞分离技术-从血液中分离细胞 免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞、造血祖细胞(CD3

10、4)、单核、单核/巨噬细胞巨噬细胞(CD14)、胰岛细胞胰岛细胞(胰岛胰岛GK和和GLUT2（葡萄糖转运子）（葡萄糖转运子）) 、多、多种肿瘤细胞等。种肿瘤细胞等。T淋巴细胞淋巴细胞已致敏抗体的免疫磁珠已致敏抗体的免疫磁珠荧光抗体荧光抗体19细胞分离技术-从血液中分离细胞20细胞分离技术-从血液中分离细胞21细胞分离技术-从血液中分离细胞22细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞MACS技术优点： 稳定、高质量的分选：纯度（90-99%） 对细胞无损伤 操作简便、快速：消毒方便，手动分选30分钟内完成，autoMACS分选2.5-10分钟之内完成。 从实验室到临床：MACS技术可以实现105-1

11、011个细胞分选。有autoMACS和CliniMACS。 分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。 从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及mRNA。MACS技术缺点：技术缺点：l分离效率较流式细胞仪分分离效率较流式细胞仪分选略低选略低l且耗材相对较贵，适合无且耗材相对较贵，适合无大型流式细胞仪设备且对分大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选选细胞纯度要求不高的分选。l只适用于简单标记的细胞只适用于简单标记的细胞分离分离23细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分

12、离细胞从血液、体液中分离细胞流式细胞术分离法分离流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：淋巴细胞： 用用RPMI-1640培养基调整单个核细胞成培养基调整单个核细胞成1107 /ml悬液；悬液； 加适量加适量FITC-抗抗CD3或或FITC-抗抗CD19，4孵育孵育30min, 用用RPMI-1640培养基洗培养基洗2次；次； 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。24细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞

13、流式细胞术分离法分离流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：淋巴细胞：从血液、体液中分离细胞血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞粒细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞B淋巴细胞淋巴细胞T淋巴细胞淋巴细胞（CD8+和和CD4+）制备细胞匀浆制备细胞匀浆细胞细胞匀浆液匀浆液 方法：方法：二二 细胞组分的分离和纯化细胞组分的分离和纯化二二 细胞器及细胞组分的分级分离细胞器及细胞组分的分级分离1 差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒2 速度沉降分离沉降系数不同的颗粒速度沉降分离沉降系数不同的颗粒3 平衡沉降分离密度不同的颗粒平衡沉降

14、分离密度不同的颗粒密度梯度密度梯度离心离心密度梯度离心密度梯度离心 密度梯度离心（密度梯度离心（density gradient centrifugation）：）：将待分离的细胞组分铺将待分离的细胞组分铺放在放在不连续介质不连续介质表面或内部，离心使细胞不表面或内部，离心使细胞不同组分以不同速率沉降，形成不同同组分以不同速率沉降，形成不同沉降带。沉降带。 类型：类型：；。 常用介质：蔗糖、多聚蔗糖、常用介质：蔗糖、多聚蔗糖、 甘油、氯化铯甘油、氯化铯 。密度密度+2 速度沉降（速度沉降（velocity sedimentation） 用途：用途：的细胞或细胞器的细胞或细胞器 原理：制备梯度离

15、心介质（密度由顶部到底部逐原理：制备梯度离心介质（密度由顶部到底部逐渐增加）渐增加）,分离物按各自的沉降系数以不同的速度分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降，形成不同的沉降带而达到分离。沉降，形成不同的沉降带而达到分离。 梯度特点梯度特点:梯度平缓，密度较低梯度平缓，密度较低( 5%-20%)，介质介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 分离效率分离效率: 取决于取决于沉降系数沉降系数间的差异。间的差异。3 平衡沉降（平衡沉降（equilibrium sedimentation） 用途：分离大小、形态相似而用途：分离大小、形态相似而密度不同密度

16、不同的组分。的组分。 特点：特点：（1）介质密度较高，陡度大）介质密度较高，陡度大(20%-70%） ，（2）所需的力场通常比速率沉降法大）所需的力场通常比速率沉降法大10100倍，往往需要倍，往往需要高速或超速离心。高速或超速离心。：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并心则沉降到与自身密度相等的介质处，并在那里达到在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。平衡，从而将不同密度的成分分离。 分离效率分离效率: 取决于取决于浮力密度间的差异浮力密度间的差异速度沉降：速度沉降：大小和形状大小和形状平衡沉降：平

17、衡沉降：浮力密度浮力密度CsCl平衡沉降证实平衡沉降证实DNA半保留复制（半保留复制（1957， Meselson，Stahl ）15N/15N-DNA15NH4Cl溶液溶液14NH4Cl溶液溶液15N/14N-DNA14N/14N-DNA15N/14N-DNA三三 蛋白质的分离与鉴定蛋白质的分离与鉴定1 层析的方法纯化蛋白质层析的方法纯化蛋白质2 电泳的方法分析、鉴定蛋白质电泳的方法分析、鉴定蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳-分子量的不同分子量的不同等电聚焦电泳等电聚焦电泳-等电点的不同等电点的不同双向电泳双向电泳-分子量和等电点的不同分子量和等电点的不同离子交换层析离子交换

18、层析-电荷的不同电荷的不同凝胶过滤层析凝胶过滤层析-分子大小的不同分子大小的不同亲和层析亲和层析-形状形状离子交换层析：是离子交换层析：是一种根据被分离物一种根据被分离物质的分子表面质的分子表面电荷电荷性质性质来分离的吸附来分离的吸附层析。层析。将具有特殊结构的亲和分子制成将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接

19、流出，从而由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，用适当的洗脱液， 改变结合条件改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。和层析。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年年由由Shapir0建立，其原理：聚丙烯酰胺凝胶是由建立，其原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺丙烯酰胺(简称简称Acr)和交联剂和交联剂N，N一亚甲基一亚甲基双双丙烯酰胺丙烯酰胺(简称简称Bis)在催化剂在催化剂过硫酸铵过硫酸铵(APS)，N，N，

20、N，N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚作用下，聚合交联形成的具有合交联形成的具有网状立体结构网状立体结构的凝胶，并以的凝胶，并以此为支持物进行电泳。此为支持物进行电泳。等电聚焦电泳等电聚焦电泳(IFE(IFE）利用聚丙烯酰胺凝利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方场作用下沿电场方向在凝胶内制造一向在凝胶内制造一个个pHpH梯度。梯度。 每种蛋白质都将迁每种蛋白质都将迁移至与它的移至与它的pI pI 相一相一致的致的pHpH处处。凝胶中加凝胶中加有两性电有两性电解质溶液解质溶液（pH9-3） 加电场后加电场后在凝胶内形在凝胶内形成一个稳定成一个稳定pH

21、梯度梯度 加样品，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明凝胶染色表明样品按照各自样品按照各自pI值沿着值沿着pH梯度分布梯度分布等等电电聚聚焦焦电电泳泳进进行行过过程程中中等等电电聚聚焦焦电电泳泳结结束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）高高pH高高pH低低pH低低pHC C 双向电泳双向电泳：等电聚焦电泳等电聚焦电泳：SDS-PAGESDS-PAGE双向电泳后的凝胶经染双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布色后蛋白呈现二维分布图：图： 水平方向反映出蛋白水平方向反映出蛋白在在pIpI上的差异，垂直方上的差异，垂直方向反映出它们在分子量向反映出它们在分子量上的差别上的差别。第一向电第

22、一向电泳：等电泳：等电聚焦电泳聚焦电泳聚焦后凝聚焦后凝胶放置在胶放置在SDS凝胶凝胶上，进行上，进行第二向电第二向电泳泳第二向电泳：第二向电泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3四四 核酸的分离纯化与鉴定核酸的分离纯化与鉴定1 差速离心沉淀是核酸分离纯化的常用方法差速离心沉淀是核酸分离纯化的常用方法2 凝胶电泳是核酸分离鉴定的主要方法凝胶电泳是核酸分离鉴定的主要方法细胞化学技术（细胞化学技术（CytochemistryCytochemistry）：在保持细胞）：在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，研结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，研究

23、细胞和细胞内的细胞器的结构、功能关系的一究细胞和细胞内的细胞器的结构、功能关系的一种技术。种技术。第四节第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术细胞化学和细胞内分子示踪技术第四节第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术细胞化学和细胞内分子示踪技术一、酶细胞化学技术一、酶细胞化学技术二、免疫细胞化学技术二、免疫细胞化学技术三、放射自显影技术三、放射自显影技术四、细胞示踪技术与应用（四、细胞示踪技术与应用（GFP）一、酶细胞化学技术一、酶细胞化学技术 通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。二、免疫细胞化学

24、技术（二、免疫细胞化学技术（ImmunocytochemistryImmunocytochemistry） 利用利用抗原和抗体的结合抗原和抗体的结合具有高敏感性和特异性的具有高敏感性和特异性的特点，用已知的经过标记的抗体检测组织与细胞中相特点，用已知的经过标记的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法。应抗原的方法。常用的标记方法：常用的标记方法：1)1)荧光标记：荧光标记：异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITCFITC）、罗丹明）、罗丹明2)2)酶标记：酶标记：辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）3)3)铁蛋白标记：铁蛋白标记：铁蛋白是含铁离子的蛋白质，在电镜铁蛋白是含铁离子的蛋白质，

25、在电镜 下铁离子可显黑色下铁离子可显黑色4)4)胶体金标记：胶体金标记：即金的水溶液，具有一般溶液的特即金的水溶液，具有一般溶液的特 性，用它与抗体标记后，经抗原抗体性，用它与抗体标记后，经抗原抗体 反应可定位抗原的存在。反应可定位抗原的存在。荧光素标记抗体的方法：荧光素标记抗体的方法： 直接法：直接法：荧光素直接和第一抗体相偶联荧光素直接和第一抗体相偶联 优点：简单方便，易于操作，省时省力优点：简单方便，易于操作，省时省力 缺点：敏感度不够，特异性不强，标记抗体需自己制备缺点：敏感度不够，特异性不强，标记抗体需自己制备间接法：间接法：荧光素先和第二抗体（抗第一抗体的抗体）偶联，再荧光素先和第

26、二抗体（抗第一抗体的抗体）偶联，再 与第一抗体作用与第一抗体作用 优点：敏感度高，特异性强，可购买不同的标记二抗优点：敏感度高，特异性强，可购买不同的标记二抗 缺点：操作比直接法复杂缺点：操作比直接法复杂三、放射自显影术三、放射自显影术(autoradiography)(autoradiography) 放射性核素在蜕变过程中发出带电粒子可使感放射性核素在蜕变过程中发出带电粒子可使感光材料感光。利用这样的特性，用放射性化合物脉光材料感光。利用这样的特性，用放射性化合物脉冲标记活细胞冲标记活细胞, ,经固定、切片后在暗处把感光乳胶经固定、切片后在暗处把感光乳胶覆盖于切片上覆盖于切片上, ,在此期

27、间在此期间, ,由于放射性同位素衰变使由于放射性同位素衰变使乳胶曝光乳胶曝光( (卤化银还原成银离子卤化银还原成银离子),),经显影、定影经显影、定影, ,根根据银粒所在部位据银粒所在部位, ,就可知道细胞中放射性物质的分就可知道细胞中放射性物质的分布。布。将放射性化合物渗入活细胞将放射性化合物渗入活细胞固定，制备光、电镜切片固定，制备光、电镜切片感光乳胶覆盖于切片上感光乳胶覆盖于切片上自显影和定影自显影和定影存放数日，放射性同位素衰变，存放数日，放射性同位素衰变，使乳胶中的卤化银还原成银离子使乳胶中的卤化银还原成银离子根据银盐颗粒的位置确定放射性物质的分布根据银盐颗粒的位置确定放射性物质的分

28、布例如，用放射性前体例如，用放射性前体3H-胸苷，胸苷，3H-尿苷显示尿苷显示DNA和和RNA合成和保留的位置合成和保留的位置67()68主要内容主要内容 GFP GFP的研究历史 GFP的应用学习要点学习要点 基本特性 机遇与重视 开阔视野69GFP 基本性状70简介 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称，简称GFP 最早是由下村修等人在最早是由下村修等人在1962年在水母中发现。其年在水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。发下，会发出绿色荧光。 由水晶水母（由水

29、晶水母（Aequorea victoria）中发现的野生型绿色荧光蛋白，中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和和475nm分别是最大和次分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的大的激发波长，它的发射波长的峰点是在峰点是在509nm71分子结构 238aa,单链单链 ; 二聚体二聚体, -桶状结构桶状结构; 单体：单体：11个个-折叠包围一个折叠包围一个-螺旋；螺旋； -桶状桶状结构直径约结构直径约3nm，高约，高约4nm，规则的氢键带，规则的氢键带 ； 其末端的短其末端的短螺旋以及环状结螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密构一起组成一个单独的致密结构域结构域 ；72发光机制 生色基团附着

30、于生色基团附着于-螺旋上螺旋上，几乎完美的包被于桶，几乎完美的包被于桶状结构中心。状结构中心。 六肽组成的发光中心六肽组成的发光中心 发光团（三肽）发光团（三肽）Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。了对羟基苯咪唑啉酮。 自身催化自身催化环化的结果环化的结果 有氧过程，有氧过程，O2使使Tyr66脱氢氧化脱氢氧化。73特点特点 GFPGFP荧光极其稳定；荧光极其稳定； 中度氧化剂对中度氧化剂对GFPGFP荧光影响也不大；荧光影响也不大； 灵敏度高灵敏度高, ,抗光漂白能力强；抗光漂白能力强； 荧光的产生不需要任何外源反应底物。荧光的产生不需要任何外源反应

31、底物。74GFP的研究历史的研究历史 从下村修到钱永健75The Nobel Prize in Chemistry 2008for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFPOsamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien 钱永健钱永健 马丁马丁查尔菲查尔菲 下村下村脩脩 2008年10月8日 76下村脩下村脩（1928年8月27日），有机化学家、海洋生物学家1928年生于日本京都，1960年获得日本名古屋大学有机化学博士学位美国Woods Hole海洋生物学实

32、验室（MBL）波士顿大学医学院名誉退休教授 77小海萤（小海萤（Cypridina hilgendorfii）1955, Nagoya University, laboratory of Prof.Yoshimasa Hirata.78Friday Harbor, 1961.Aequorea victoria Prof.Frank Johnsons Lab, Princeton, NJ, 195979Shimomura O, Johnson F, Saiga Y (1962). Extraction, purification and properties of aequorin, a bio

33、luminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59: 22339 水母素水母素aequorinGFP80600 rings per hour（ 10 times more than by hand.）3040 bucketfuls of jellyfish each day. 1 mg of AF-350 150 mg of purified aequorin 50,000 jellyfish.2004811974年，纯化到了这个蛋白，年，纯化到了这个蛋白， 时称绿色蛋白、以后

34、称绿色荧光蛋白时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP。 同年，荧光共振能量转移同年，荧光共振能量转移(FRET)在生物中发现在生物中发现“荧光素荧光素GFP ”1979年，年，GFP的发色基团确定的发色基团确定 酶解法酶解法 821992年，年，Douglas Prasher拿到了拿到了GFP的基因（的基因（Woods Hole海洋研究所）海洋研究所）(Douglas Prashers) work was critical and essential for the work we did in our lab. They couldve easily given the prize to D

35、ouglas and the other two and left me out. -Martin ChalfieIm really happy for them. I was really surprised that particular topic carried that much weight . -Douglas Prasher83马丁马丁查尔菲查尔菲（Martin Chalfie，1947年），美国科学家成长于美国芝加哥1977年获得美国哈佛大学神经生物学博士学位1982年起任美国哥伦比亚大学生物学教授。 84Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G.

36、, Ward, W. W., and Prasher, D. C. (1994), “Green fluorescent protein as a marker for gene expression,” Science 263: 802805.85钱永健钱永健Roger Yonchien Tsien（1952年2月1日）美国生物化学家美国国家科学院院士美国国家医学院院士美国艺术与科学院院士圣地牙哥加利福尼亚大学生物化学及化学系教授。1972年，哈佛大学化学及物理学最优等学士学位。1977年，英国剑桥大学生理学博士学位。1977年-1981年，剑桥大学研究员。8687“当然，我希望各个国家的年

37、轻人都能受到激励，但我知道，中国人对此会尤其感到骄傲”。 “可能因为我是华裔，很多中国人可能受到很大鼓舞，希望更多的中国年轻人也投身到基础理论研究中来。” “我是在美国出生长大的，我不是中国科学家我的得奖有中国人高兴，如果这样让很多年轻人对科学发生兴趣，这是很好的事。”88GFP的应用的应用1、骨架和细胞分裂、骨架和细胞分裂 ；2、细胞器动力学和泡囊运输、细胞器动力学和泡囊运输 ；3、发育生物学、发育生物学 ；4、神经生物学、神经生物学 ；5、其他应用、其他应用 ；89细胞骨架actintublin拟南芥胚轴微管拟南芥胚轴微管- GFPA hairy root of Medicago trun

38、catula expressing a GFP fusion to the microtubule 90细胞分裂GFP-tubulin 91细胞器动力学和泡囊运输Treatment of stable HeLa cells expressing EGFP-LC3 with an autophagy-inducing small molecule increases the formation of autophagic vesicles (EGFP-positive punctate structures). Sarkar et al, Nat Chem Biol, 3(6):331-338

39、(2007).92发育生物学Long term 4D imaging of Caenorhabditis elegans embryo93神经生物学9495gfppMRP9-1电击转化电击转化FRD1FRD1-GFP96FRD1明视场观察明视场观察 激发荧光观察激发荧光观察 97Thanks！第四节第四节 细胞功能基因组学研究技术细胞功能基因组学研究技术一、一、基因表达的定量分析基因表达的定量分析二、二、基因表达的上调和下调技术基因表达的上调和下调技术三、三、蛋白质相互作用的研究技术蛋白质相互作用的研究技术四、四、蛋白质与核酸相互作用的研究技术蛋白质与核酸相互作用的研究技术五、生物芯片技术五、

40、生物芯片技术六、蛋白质组学技术六、蛋白质组学技术七、高通量测序技术七、高通量测序技术一、一、基因表达的定量分析基因表达的定量分析1 印迹杂交技术是定量检测基因表达的基本方法印迹杂交技术是定量检测基因表达的基本方法2 原位杂交可提供基因表达的时空信息原位杂交可提供基因表达的时空信息3 荧光实时定量荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的技术是检测基因表达变化的 常规方法常规方法Northern印迹分析印迹分析-特异性特异性mRNAWestern印迹分析印迹分析-蛋白质分子蛋白质分子核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular

41、 Hybridization 核酸分子杂交核酸分子杂交 （nucleotide molecular hybridization）以以DNADNA的的变性变性、复性复性为理论基础；为理论基础；指具有一定同源序列的两条核酸单链指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNADNA或或RNARNA），在一定条件下按碱基互），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成补配对原则经过复性处理后，形成异源异源双链双链的过程。的过程。 Southern印迹印迹（Southern blot） 基本操作过程基本操作过程待测待测DNADNA样品制备样品制备、基因探针标记；基因探针标记；待测待测DNADNA样品的电

42、泳分离；样品的电泳分离；电泳分离的电泳分离的DNADNA经变性、转移、固定到合适的经变性、转移、固定到合适的固相支持物；固相支持物；特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNADNA片段杂交，放射自片段杂交，放射自显影或显色检测目的显影或显色检测目的DNADNA的存在。的存在。 Southern blot基本流程基本流程电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物Southern blot关键步骤关键步骤 待测待测DNADNA样品的酶切消化样品的酶切消化 基因组基因组DNADNA进行消化，才能在电泳过程进行消化，才能在电泳过程 中将不

43、同长短的中将不同长短的DNADNA片段分离开。片段分离开。 基因探针的标记基因探针的标记 探针序列和探针信号的选择探针序列和探针信号的选择。要考虑。要考虑 特定基因的重复性特定基因的重复性、保守性和稳定性。保守性和稳定性。 可用同位素和非同位素标记。可用同位素和非同位素标记。 Northern 印迹（印迹（Northern blot） 是将是将RNARNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析上，定性分析mRNAmRNA的常用方法。的常用方法。 注意事项：注意事项：RNARNA易被酶降解。易被酶降解。 可用于分析可用于分析基因转录基因转录水平的变化水平的变化 。Wes

44、tern blot （蛋白免疫印迹）技术（蛋白免疫印迹）技术 是将是将蛋白质蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转印从聚丙烯酰胺凝胶中转印到到化学合成膜的支撑物上化学合成膜的支撑物上，利用特异性，利用特异性抗体抗体进行反应，定性分析蛋白质。进行反应，定性分析蛋白质。 用于分析用于分析基因表达基因表达(蛋白水平）蛋白水平）的变化。的变化。一抗一抗一抗一抗(兔抗兔抗Actin) 曝光后的蛋白条带曝光后的蛋白条带二抗二抗 (辣根酶标记的羊抗兔辣根酶标记的羊抗兔IgG)ECLX光片曝光显影光片曝光显影ECL 试剂试剂含有转印蛋白的含有转印蛋白的PVDF膜膜 +转印膜上蛋白检测示意图转印膜上蛋白检测示意图 WB结果

45、分析结果分析原位分子杂交技术原位分子杂交技术 利用分子杂交技术来进行基因及其表达利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物产物定位分析定位分析的一种技术。的一种技术。 组织、细胞或染色体的固定；组织、细胞或染色体的固定； 探针；探针； 与探针结合的标记物；与探针结合的标记物； 可用于基因及其可用于基因及其表达产物的定位分析表达产物的定位分析。聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种在是一种在体外特异地扩增已知基因体外特异地扩增已知基因的方的方法；法；由由K. M

46、ullis于于19831983年建立年建立；19991999年获诺年获诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析；PCR PCR 体系体系 模板模板 引物引物 耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 dNTPsdNTPs 含含MgMg2+2+的缓冲液的缓冲液PCRPCR的过程的过程 变性变性(Denaturing) 95DNA 95DNA模板变性成为单链，引物自身和模板变性成为单链，引物自身和引物间的局部双链消除引物间的局部双链消除 退火退火(Annealing) 引物与模板引物与模板DNADNA杂交，杂交，

47、Tm值减值减5 延伸延伸(Extension) DNA DNA聚合酶在聚合酶在7272催化催化DNADNA的合成的合成ingPCR技术的工作原理技术的工作原理117PCRPCR技术技术 PCRPCR分析已知基因；分析已知基因； 反转录反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将是将RNARNA的反转录和的反转录和PCRPCR联合应用联合应用的一种技术。的一种技术。 RT-PCRRT-PCR是从组织或细胞中获得目的基因是从组织或细胞中获得目的基因及对已知序列的及对已知序列的RNARNA进行定性及半定量分析进行定性及半定量分析的有效方法。的有效方法。 RT-

48、PCRRT-PCR与与PCRPCR区别区别 模板为模板为mRNAmRNA 需逆转录酶需逆转录酶 产物为产物为cDNAcDNA119mRNA 5 AAAAAA(n) 3 mRNA 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 mRNA 5 cDNA 3 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 oligo(dT)12-18反转录酶反转录酶RNase HDNA 聚合酶聚合酶S1 核酸酶核酸酶3 cDNATTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 反转录合成反转录合成cDNAcDNA 实时、定量实时、定量PCRP

49、CR技术技术 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧，利用荧光信号积累实时检测整个光信号积累实时检测整个PCRPCR进程。通过标准进程。通过标准曲线对样品中的曲线对样品中的DNADNA的起始浓度进行定量的方的起始浓度进行定量的方法。法。 特点：对特点：对DNA/RNADNA/RNA模板定量，灵敏度强，模板定量，灵敏度强，特异性高。特异性高。121实时、定量实时、定量PCRPCR技术技术QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355DNADNA序列测定序列测定DNA SequencingDNADNA序列分析方法序列分析方法 双脱氧

50、链终止法双脱氧链终止法 利用利用2，3 -双脱氧核苷酸掺入中，双脱氧核苷酸掺入中， 终止化学反应终止化学反应 化学裂解法化学裂解法 利用化学试剂裂解修饰碱基终止聚合反应利用化学试剂裂解修饰碱基终止聚合反应 戊戊 糖糖（RNA）1 2 3 4 5 OHOCH2OHOHOH核糖核糖(ribose)（DNA）OHOCH2OHOH脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)DNADNA的序列测定的序列测定55端端3端端CGA126双脱氧链终止法双脱氧链终止法dADNA自动测序自动测序用不同用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行然后进行SangerSanger测序反应，反

51、应产物经电测序反应，反应产物经电泳分离后，通过四种激光激发不同大小泳分离后，通过四种激光激发不同大小DNADNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定定DNADNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 DNADNA序列自动分析序列自动分析ddG红红ddTddA绿绿ddC蓝蓝橙橙毛细管电泳毛细管电泳荧光标记荧光标记DNA合成合成测序结果展示测序结果展示DNA自动测序结果举例DNADNA序列分析可以揭示基因和序列分析可以揭示基因和基因组基因组一级结构一级结构变化变化 通过通过DNADNA序列分析

52、可以鉴定基因和基因组的序列分析可以鉴定基因和基因组的变异变异 通过通过DNADNA序列测定分析人工重组的基因序列测定分析人工重组的基因 通过通过DNADNA序列测定对定点突变进行确认序列测定对定点突变进行确认 DNADNA芯片技术芯片技术DNA Chip Technologies DNA DNA芯片芯片（DNA chip） 也称也称DNADNA微阵列微阵列(DNA microarray)在固相支持物上有序固化寡核苷酸或在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNADNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，通过对杂交信号的检测、比较和分析

53、，得出样品的遗传信息；得出样品的遗传信息； 包括包括cDNAcDNA芯片和寡核苷酸微阵列芯片和寡核苷酸微阵列基因芯片工作流程基因芯片工作流程DNADNA芯片技术芯片技术 cDNAcDNA芯片芯片 探针是探针是cDNAcDNA片段，可以同任何具有同源序列片段，可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。达。 寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片 基因特异的寡核苷酸片段为探针，对低丰度基因特异的寡核苷酸片段为探针，对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。 可进行高通量基因转录活性的分析可进行高通量基因

54、转录活性的分析 DNADNA芯片技术的特点芯片技术的特点 快速快速、高效高效、敏感敏感、平行化平行化、自动化。自动化。 通过芯片技术筛选得到的表达信息还要用通过芯片技术筛选得到的表达信息还要用N Northern blot或定量或定量RT-PCR进行验证进行验证 DNADNA芯片技术的应用芯片技术的应用 肿瘤基因表达谱的差异研究；肿瘤基因表达谱的差异研究； 基因多态性分析；基因多态性分析； 微生物筛选鉴定；微生物筛选鉴定； 遗传病产前诊断等遗传病产前诊断等 蛋白质芯片和组织芯片蛋白质芯片和组织芯片 蛋白质芯片蛋白质芯片 蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片 组织芯片组织芯

55、片 是以形态学为基础进行高通量检测基因是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信息的芯片技术表达信息的芯片技术 蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片 是将成千上万种蛋白质如是将成千上万种蛋白质如抗原抗原、抗体抗体、受体或酶受体或酶在固相载体表面高度密集排列在固相载体表面高度密集排列构成探针蛋白点阵，然后依据蛋白质分构成探针蛋白点阵，然后依据蛋白质分子间或蛋白质与核酸间相互作用的原理子间或蛋白质与核酸间相互作用的原理与待测样品杂交，实现高通量的检测和与待测样品杂交，实现高通量的检测和分析。分析。 蛋白质芯片技术优势蛋白质芯片技术优势 在蛋白质结构在蛋白质结构、功能和相互作用，以及功能和相互作用，以及疾病发

56、展过程中蛋白表达谱差异研究等方疾病发展过程中蛋白表达谱差异研究等方面。面。 在临床医学研究中，利用蛋白质芯片技在临床医学研究中，利用蛋白质芯片技术寻找新的术寻找新的肿瘤标记物肿瘤标记物，各种，各种肿瘤标记物肿瘤标记物的筛选的筛选，用于，用于早期诊断早期诊断和治疗效果的监测。和治疗效果的监测。 组织芯片组织芯片 应用成百上千的处于自然或病理状态下应用成百上千的处于自然或病理状态下的的组织标本组织标本，同时研究一个或多个，同时研究一个或多个特定基因特定基因及其表达及其表达产物的技术。产物的技术。 将组织标本集成在一张固相载体上形成将组织标本集成在一张固相载体上形成微缩组织切片，在组织切片上高通量获

57、取基微缩组织切片，在组织切片上高通量获取基因的表达信息。因的表达信息。 应用：肿瘤病理学（病因应用：肿瘤病理学（病因、诊断诊断、肿瘤标肿瘤标记物筛选记物筛选、治疗等）治疗等）基因表达的上调和下调技术基因表达的上调和下调技术1 外源基因在细胞中的过表达是上调基因表达外源基因在细胞中的过表达是上调基因表达 的主要方式的主要方式2 RNA干扰是下调基因表达的主要方式干扰是下调基因表达的主要方式RNARNA干扰的研究进展干扰的研究进展一一. RNAi. RNAi简介简介二二. RNAi. RNAi作用机制作用机制三三. RNAi. RNAi的生物学功能的生物学功能五五. RNAi. RNAi展望展望四

58、四. RNAi. RNAi应用应用一、一、RNARNA干扰的简介干扰的简介 RNA RNA 干扰干扰(RNA interference, RNAi)(RNA interference, RNAi)是是近年来新发现的一种重要的基因表达调控近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式，它是由内源产生或人为转染进入细方式，它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰双股胞的小干扰双股RNARNA（small interfering small interfering double strand RNAdouble strand RNA，siRNA)siRNA)诱导产生的一诱导产生的一种转录后基因沉默种转录后

59、基因沉默(post-transcriptional (post-transcriptional gene silencinggene silencing，PTGS)PTGS)现象。现象。 19901990年，年，JorgensenJorgensen等将产生色素的基因导入矮牵牛中等将产生色素的基因导入矮牵牛中，试图加深花朵的颜色，结果很多花没有变成深紫色，试图加深花朵的颜色，结果很多花没有变成深紫色，反而成了花斑的甚至白的。表明不仅导入的基因未，反而成了花斑的甚至白的。表明不仅导入的基因未表达，而且本身同源的基因失活。从而发现在转基因表达，而且本身同源的基因失活。从而发现在转基因植物中存在基因表

60、达的植物中存在基因表达的共抑制共抑制现象，即转入的外源基现象，即转入的外源基因和本身的同源基因都被抑制，出现基因沉默现象。因和本身的同源基因都被抑制，出现基因沉默现象。父本转基因后代n19981998年年FireFire等证实，将制备的等证实，将制备的RNARNA高度纯化高度纯化后发现，单链后发现，单链RNARNA的基因抑制作用很微弱，的基因抑制作用很微弱，而用纯化后的而用纯化后的dsRNAdsRNA却能高效、特异地阻断却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明相应基因的表达。实验证明双链双链RNARNA抑制基抑制基因的表达的效率比纯化后的反义因的表达的效率比纯化后的反义RNARNA至少高至