实验2－柱层析技术分离纯化菠萝蛋白酶粗提液

1、一、实验目的一、实验目的1 1 学习和理解蛋白质进一步纯化的学习和理解蛋白质进一步纯化的各种各种柱层析技术柱层析技术的原理和实验技的原理和实验技能。能。2 2 理解和掌握理解和掌握葡聚糖（葡聚糖（SephadexGSephadexG- - 7575）柱层析技术）柱层析技术原理和实验操作原理和实验操作步骤。步骤。二、实验原理二、实验原理 凝胶层析（凝胶层析（Gel chromatographyGel chromatography）是利用是利用具有一定孔径的具有一定孔径的多孔凝胶多孔凝胶作为固定相，把作为固定相，把分子大小不同的物质分离开来的一种层析分子大小不同的物质分离开来的一种层析技术技术.

2、. 凝胶过滤凝胶过滤（Gel filtrationGel filtration） 分子筛分子筛（Molecular sieve Molecular sieve chromatographychromatography） 凝胶渗透层析凝胶渗透层析（Gel permeation Gel permeation chromatographychromatography） 经常使用的凝胶：经常使用的凝胶： 葡聚糖凝胶（商品名为葡聚糖凝胶（商品名为SephadexSephadex） 聚丙烯酰胺凝胶（生物胶、聚丙烯酰胺凝胶（生物胶、Bio Gel PBio Gel P） 琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（Sephar

3、oseSepharose gel gel）及由烷基葡聚）及由烷基葡聚 糖与甲叉丙烯酰胺共价交联制成的糖与甲叉丙烯酰胺共价交联制成的SephacrylSephacryl 等。等。 葡聚糖凝胶用得最多葡聚糖凝胶用得最多，它是，它是-1-1，6 6葡聚糖与葡聚糖与1-1-氯氯-2-2，3-3-环氧丙烷反应交联而成的环氧丙烷反应交联而成的 ，有不同，有不同型号的凝胶。型号的凝胶。 凝胶的吸水能力与凝胶的交联度关系密切：凝胶的吸水能力与凝胶的交联度关系密切： G表示交联度，交联度大的，凝胶孔径小，吸表示交联度，交联度大的，凝胶孔径小，吸 水量少，膨胀程度小。水量少，膨胀程度小。 凝胶孔径的大小可以用其吸

4、水量的大小来表凝胶孔径的大小可以用其吸水量的大小来表 示，常以示，常以G-10至至G-200号码标记。号码标记。 G后面的数字是凝胶吸水量（后面的数字是凝胶吸水量（ml/g干胶）乘以干胶）乘以 10所得的值。所得的值。 G-25：表示吸水量为表示吸水量为2.5ml/g干胶。干胶。 G100：表示该颗粒胶实际吸水值的表示该颗粒胶实际吸水值的10倍。倍。 G值愈小，交联度愈大，因此吸水量也愈小。值愈小，交联度愈大，因此吸水量也愈小。 Sephadex G100 吸水值大，但机械性能不好，吸水值大，但机械性能不好，较较 软。软。 Sephadex G50 吸水值小，但机械性能好，能吸水值小，但机械性

5、能好，能承受较大静水压。快流速。承受较大静水压。快流速。 G值小，交联度越大值小，交联度越大，网状结构致密，颗粒内，网状结构致密，颗粒内孔径越小，吸水值小，孔径越小，吸水值小，分级范围窄，分级范围窄，机械性能机械性能好。好。 G值大值大，交联度越小交联度越小，网状结构疏松，颗粒内，网状结构疏松，颗粒内孔径越大，吸水值大，孔径越大，吸水值大，分级范围宽，分级范围宽，机械性能机械性能不好。不好。 Sephadex G10 - Sephadex G50: 通常用于分离通常用于分离1.5KD30KD的肽或的肽或小分子蛋小分子蛋白质或脱盐等。白质或脱盐等。 Sephadex G75 - Sephadex

6、 G200 : 分离分离分子量大分子量大于于5KD800KD的蛋白质的蛋白质. 吸水量大，预处理膨胀所需时间较长，膨胀度吸水量大，预处理膨胀所需时间较长，膨胀度较大，因此称为软胶较大，因此称为软胶. 进行柱层析冼脱时，柱床上端洗脱液的压力保进行柱层析冼脱时，柱床上端洗脱液的压力保持恒定。持恒定。 凝胶层析原理凝胶层析原理 当分子大小不同的蛋白质混合物流经以凝胶当分子大小不同的蛋白质混合物流经以凝胶为固定相的层析柱时，为固定相的层析柱时， 比凝胶网孔比凝胶网孔大大的分子的分子不能进入网状结构，只能不能进入网状结构，只能排阻在凝胶之外，随流动相在凝胶颗粒之间移动排阻在凝胶之外，随流动相在凝胶颗粒之

7、间移动并最并最先流出先流出柱外；柱外； 比网孔比网孔小小的分子的分子能完全渗入孔内最能完全渗入孔内最后流出后流出柱外；柱外； 若分子量完全介于上述二者之间若分子量完全介于上述二者之间，则居中流出。，则居中流出。 从流出次序的不同即可达到分离纯化蛋白从流出次序的不同即可达到分离纯化蛋白质的目的。质的目的。 小颗粒（小分子量）小颗粒（小分子量）进入进入gelgel的孔内扩散，的孔内扩散，流动速度慢，流动速度慢，后冼脱后冼脱； 大颗粒（大分子量）大颗粒（大分子量）不进入不进入gelgel的孔内，滑的孔内，滑动速度快，动速度快，先洗脱先洗脱。 三实验材料三实验材料实验一所提的菠萝蛋白酶粗提样品实验一所

8、提的菠萝蛋白酶粗提样品四实验设备四实验设备电子天平电子天平层析柱层析柱(2 x 20cm)(2 x 20cm)恒流泵恒流泵自动部分收集器自动部分收集器水浴锅水浴锅751-751-紫外分光光度计紫外分光光度计五玻璃器皿五玻璃器皿烧杯、胶管、吸管、夹子、铁架台、收集器的指烧杯、胶管、吸管、夹子、铁架台、收集器的指管、滴管，移液器等。管、滴管，移液器等。六实验试剂六实验试剂1、Sephadex G75（葡聚糖（葡聚糖G75）2、柱层析试剂、柱层析试剂 0.1moL/L PBS 2000mL1000 mL pH7.83、测酶活试剂：、测酶活试剂： （1）1%酪蛋白酪蛋白300mL： 用用0.1 mol

9、/L PBS pH7.8配配, 50水浴溶解。水浴溶解。 （2）激活剂激活剂 300mL： 含有含有20 mmol/L半胱氨酸半胱氨酸-盐酸盐和盐酸盐和1mmol/L EDTA-Na，用，用0.1 mol/L PBS pH7.8溶解，最后定容至溶解，最后定容至300mL。 （3 3）5%TCA5%TCA（三氯乙酸）（三氯乙酸）400mL400mL 4 4、酶液浓缩、酶液浓缩 （1 1）透析袋处理（用于浓缩）：）透析袋处理（用于浓缩）：新买新买的透析袋，裁剪成所需大小，用加洗衣粉的透析袋，裁剪成所需大小，用加洗衣粉或洗洁剂的自来水浸泡煮沸或洗洁剂的自来水浸泡煮沸10 min，镊子，镊子取出，用自

10、来水漂洗干净，再用取出，用自来水漂洗干净，再用dH2O漂洗漂洗1-2次，即可使用。次，即可使用。 （2 2）PEGPEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）60006000 七实验步骤七实验步骤（一）凝胶的预处理（一）凝胶的预处理1、凝胶（干粉）必须使用前在过量的溶剂中充分凝胶（干粉）必须使用前在过量的溶剂中充分吸胀，一般多为吸胀，一般多为dH2O、盐溶液或、盐溶液或 buffer，放置，放置室温较长时间，使之充分吸胀。室温较长时间，使之充分吸胀。 浸泡时间：根据交联度不同而异，浸泡时间：根据交联度不同而异，G50需需6h。 注意：注意：不要过分搅拌，以防止颗粒破碎不要过分搅拌，以防止颗粒破碎，防止破，防

11、止破坏胶链结构。坏胶链结构。2、用倾泻法出去混杂的小颗粒，重复、用倾泻法出去混杂的小颗粒，重复3到到4次，以次，以防止粉末等物质塞住胶孔。防止粉末等物质塞住胶孔。3、加热、加热100溶胀，不同交联度，时间不同，溶胀，不同交联度，时间不同，G50需需2h，可杀死细菌和霉菌，且可排除凝胶内包藏可杀死细菌和霉菌，且可排除凝胶内包藏的气泡。的气泡。（二）柱的选择（二）柱的选择 1 1、为了防止分离受管壁效应的影响，一般应选用内径、为了防止分离受管壁效应的影响，一般应选用内径大于大于2.5cm2.5cm的柱（本实验为的柱（本实验为2cm2cm）或最好用直径为）或最好用直径为23cm23cm的柱。的柱。

12、管壁效应：管壁效应：在柱管中心部位组分移动较慢，而在管在柱管中心部位组分移动较慢，而在管壁周围移动较快，因而影响分离效果。壁周围移动较快，因而影响分离效果。2 2、柱的长度通常为柱的长度通常为5050100cm100cm：柱高柱高50cm 50cm 适用于脱盐，适用于脱盐，柱高柱高100cm100cm，蛋白质分级分离较好。，蛋白质分级分离较好。 一般说，柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验一般说，柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，且样品稀释度大，易扩散。反而效果不好时间长，且样品稀释度大，易扩散。反而效果不好 （三）安装设备（三）安装设备 柱子、恒流泵、自动部分收集器，并柱子、恒流泵

13、、自动部分收集器，并调好流速。调好流速。 主要看老师操作演示。主要看老师操作演示。（四）装柱（四）装柱（最重要的操作步骤最重要的操作步骤）1 1、首先垂直的安装好玻璃层析柱，、首先垂直的安装好玻璃层析柱， 出口的胶出口的胶管管不能留有气泡不能留有气泡。2 2、在柱中、在柱中先装先装10mL10mL的水的水，将已溶胀的凝胶沿着，将已溶胀的凝胶沿着玻璃棒小心的徐徐的灌入柱中，让其自然下玻璃棒小心的徐徐的灌入柱中，让其自然下降以免出现不均匀的凝胶带。降以免出现不均匀的凝胶带。3 3、装柱时需打开下口，并调节适当流速。装柱时需打开下口，并调节适当流速。4 4、注意事项、注意事项 （1 1）凝胶不能太稀

14、或太粘稠，若太稀分几次）凝胶不能太稀或太粘稠，若太稀分几次装上的凝胶床往往不均匀，过于粘稠，会装上的凝胶床往往不均匀，过于粘稠，会吸留气泡。吸留气泡。（2 2）凝胶柱床必须装得十分均匀凝胶柱床必须装得十分均匀。（3 3）在任何时候不要使液面低于凝胶表面，）在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则凝胶变干，出现裂层，且有可能混入否则凝胶变干，出现裂层，且有可能混入气泡，气泡，对蛋白分离不利。对蛋白分离不利。（五）加样（五）加样1 1、凝胶沉集后，、凝胶沉集后，调整流速调整流速，加一滤纸或尼龙滤，加一滤纸或尼龙滤布于凝胶面上，以防止加样时，凝胶被冲起或布于凝胶面上，以防止加样时，凝胶被冲起或不平。不

15、平。3、接上恒流泵（注意：恒流泵速度不能太高或、接上恒流泵（注意：恒流泵速度不能太高或全速），继续用蒸馏水洗柱子，约全速），继续用蒸馏水洗柱子，约0.51 h。4、调整恒流泵流速，使每管、调整恒流泵流速，使每管4 mL，每，每6 min收收集集1管（管（4 mL/管管/6 min）。）。5、调整好部分收集器，使其转动的速度为、调整好部分收集器，使其转动的速度为1管管/6 min。 6 6、加样量加样量为层析柱体积的为层析柱体积的1.2%1.2%，如，如100ml100ml体积，加样体积，加样12ml12ml，2 220cm20cm的柱的柱体积为体积为62.8 ml62.8 ml，装柱体积，装柱

16、体积50 ml50 ml，加加样样0.50.51.2ml1.2ml。7 7、用、用吸管取吸管取1 11.2ml1.2ml粗蛋白溶液，小心的将粗蛋白溶液，小心的将样品加到凝胶床的表面滤纸上。样品加到凝胶床的表面滤纸上。!注意：注意： （1 1）加样时勿将床面凝胶冲起）加样时勿将床面凝胶冲起 （2 2）不要沿壁管加样（因为样品易从柱壁与凝）不要沿壁管加样（因为样品易从柱壁与凝胶床之间漏下）胶床之间漏下） （3 3）打开出口管，待样品恰好进入柱后，用少）打开出口管，待样品恰好进入柱后，用少量量PBS洗一下凝胶表面和接触过样品的柱壁，洗一下凝胶表面和接触过样品的柱壁，待完全流入床后，再加待完全流入床后

17、，再加PBS进行洗脱。进行洗脱。（六）洗脱（六）洗脱 （1 1）洗脱液：）洗脱液：0.1moL/L PBS pH7.8 （2 2）调节流速：）调节流速： 每管每管4ml4ml，每，每6min6min收集收集1 1管管 即即4ml/4ml/管，管，6min/6min/管管 共收集共收集20202525管。管。（七）（七） 实验检测和酶活测定实验检测和酶活测定（1）用紫外分光光度计测各管的）用紫外分光光度计测各管的A280（2）A280数值高（大于数值高（大于0.2）的管进行酶活测）的管进行酶活测定定A275（3）把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混）把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干

18、净的透析袋，在一起，到入干净的透析袋，用聚乙二醇用聚乙二醇6000吸水，直到酶液浓缩到吸水，直到酶液浓缩到1ml，用吸管把，用吸管把酶取出，酶取出，-10保存，保存，留到下次电泳实验用。留到下次电泳实验用。总的实验流程总的实验流程装柱（装柱时装柱（装柱时, ,柱内留柱内留10 mL10 mL 的水的水, ,倒入倒入SephadexSephadex G75 G75，要，要求求SephadexSephadex G75 G75均匀，大约均匀，大约1.5h1.5h） 调节流速调节流速4mL/4mL/管管/6/6分（注意：恒流泵的转速不能太高）分（注意：恒流泵的转速不能太高）加样加样: :约约1.2mL

19、1.2mL收集管（收集收集管（收集20202525管）管）用紫外分光光度计测各管的用紫外分光光度计测各管的A280（蛋白含量测定）（蛋白含量测定）A280数值高的管进行酶活测定：按下表进行，其中，以一数值高的管进行酶活测定：按下表进行，其中，以一管作为对照。管作为对照。把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干净把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干净的透析袋，的透析袋，用用PEG6000吸水，直到酶液浓缩到吸水，直到酶液浓缩到1 mL，用，用吸管把酶取出，吸管把酶取出， -10保存，留到下次电泳实验用。保存，留到下次电泳实验用。 把把Sephadex G75倒到烧杯中倒到烧杯

20、中 清洗干净层析柱、部分收集器、恒流泵的塑料管清洗干净层析柱、部分收集器、恒流泵的塑料管试剂对照(调零)试管1TCA(mL)1%酪蛋白 (mL)酶液(mL)激活剂(mL)31010910.10.937 水浴 10minTCA(mL) 3静置1015min ，滤纸过滤A275nmA275nm 酶活单位(U) 酶活单位：酶活单位： 在上述条件下在上述条件下(37, 酶促反应酶促反应10min)，每，每10min增加增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（单位（U）。）。实验结实验结果果试试 管管1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010A280nm A280nm A275nm A275nm 酶活酶活(U) (U) 111112121313141415151616171718181919202