现代生物实验技术培训学习教案

1、会计学1第一页，共110页。培训培训(pixn)目目的的 掌握基本的实验技能； 了解一些先进的实验手段及大型仪器的应用； 在课题设计中如何(rh)将组织形态学，细胞学，分子生物学的 手段结合起来，进行不同层面的研究； 了解实验中心的运行方式；第1页/共109页第二页，共110页。 医学实验(shyn)中心管理制度1：可以申请使用大型仪器的补贴；大型仪器的使用需要提前预约；2：冰箱管理制度：免费使用低温冰箱；普通冰箱三个月清理一次；3：门禁制度：采用刷卡制；4：其他：技术服务(fw)；资料室的网络使用；投诉信箱等。第2页/共109页第三页，共110页。第一章 免疫组化技术(jsh)第3页/共10

2、9页第四页，共110页。主要主要(zhyo)内内容容理理 论论 基基 础础1 操作流程及基本技术操作流程及基本技术2常常 见见 问问 题题3第4页/共109页第五页，共110页。基础理论基础理论第5页/共109页第六页，共110页。基本基本(jbn)技技术术免疫免疫(miny)酶组化技术酶组化技术免疫荧光技术免疫荧光技术(jsh)示踪的两大技术示踪的两大技术第6页/共109页第七页，共110页。实验实验(shyn)流流程程组织材料组织材料(cilio)(cilio)的制备的制备 细胞细胞(xbo)玻片的制备玻片的制备石蜡切片冰冻切片细胞爬片细胞滴片第7页/共109页第八页，共110页。DAB显

3、色(xin s)操作操作(cozu)流流程程抗原(kngyun)修复内源性过氧化物抑制正常血清封闭第一抗体酶标记抗体第二抗体以免疫酶组化为例第8页/共109页第九页，共110页。结果(ji gu)分析免疫酶组化结果 图像分析 荧光显微镜 免疫荧光结果 激光(jgung)共聚焦显微镜第9页/共109页第十页，共110页。常见问题 组织或细胞脱片 抗原修复时间，方式(fngsh) 一抗稀释度 DAB显色 非特异性背景第10页/共109页第十一页，共110页。兔股骨头BMP-2染色(rns)（复染后）人肝癌(n i)HepG2细胞P42染色人乳腺癌HeLa细胞P42荧光染色第11页/共109页第十二

4、页，共110页。第二章 激光捕获(bhu)显微切割第12页/共109页第十三页，共110页。基本基本(jbn)内内容容激光捕获显微切割的应用激光捕获显微切割的应用3 激光捕获显微切割的原理激光捕获显微切割的原理2 激光捕获显微切割的发展历史激光捕获显微切割的发展历史1 激光捕获显微切割的优点激光捕获显微切割的优点4 第13页/共109页第十四页，共110页。激光捕获激光捕获(bhu)显微切割的发展显微切割的发展历史历史 激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)是一项在显微镜直视下，快速从组织切片(qi pin)中分离，纯化单一类型细胞群或单个细胞的

5、技术。 手工（mannual)显微切割显微(xin wi)操纵器（micromanipulator)切割激光束（laser microbeam)切割1996年美国国立卫生院国家肿瘤研究所推出LCM技术间接获取靶细胞间接获取靶细胞第14页/共109页第十五页，共110页。激光捕获(bhu)显微切割的原理 激光捕获显微切割的基本原理是通过低能红外激光脉冲激活热塑膜乙烯乙酸乙烯酯聚合物（ethylene vinyl acetate polymer, EVA膜) ，随后瞬时冷却，选择性地将靶细胞粘附于膜上，再通过特定的裂解液将靶细胞转运至EP管中。EVA膜具有透明的热塑性，含有吸收近红外线的特殊染料，

6、不吸收显微镜所使用的可见光，当使用(shyng)波长与该染料所特异吸收的波长相一致的激光束照射时，激光的能量绝大部分被EVA膜吸收，随着温度的升高，EVA膜的粘滞度急剧下降，保证了局部的轻度加热就能使其渗透到细胞间隙，并迅速冷却，固化成牢固的连接，足以使靶细胞脱离切片。第15页/共109页第十六页，共110页。激光(jgung)捕获显微切割的应用DNA水平(shupng)的研究RNA水平(shupng)的研究蛋白质水平的研究第16页/共109页第十七页，共110页。激光捕获显微切割(qig)的优点v 快速，简便，易行；还可避免无关细胞和碎片的污染。v 准确度高。定位准确程度(chngd)可以达

7、到1m,捕获点范围达到v 3-5m,因而足以捕获单个细胞。v 细胞内分子结构完整。不仅捕获的细胞结构完整，而且v 剩余组织的结构也未破坏。v 特异性强。第17页/共109页第十八页，共110页。第18页/共109页第十九页，共110页。食管癌组织癌细胞的激光食管癌组织癌细胞的激光(jgung)捕获显微切割照片捕获显微切割照片切割(qig)前组织照片切割后组织(zzh)照片切割下来的组织照片第19页/共109页第二十页，共110页。第20页/共109页第二十一页，共110页。基本基本(jbn)内内容容 图像信号采集的原理图像信号采集的原理1 图像信号采集的应用图像信号采集的应用2第21页/共10

8、9页第二十二页，共110页。图像信号(xnho)采集系统原理输 入 系 统光 电 转 换图像(t xin)采集系统A/D转换(zhunhun)计算机系统图像处理的核心输 出 系 统打印机，光盘等第22页/共109页第二十三页，共110页。 一一.图像分析系统主要应用图像分析系统主要应用 1：图像处理：图像处理:图像质量的改善图像质量的改善,主要指对医学主要指对医学或或 生物成像的处理与编辑，提高图像的反生物成像的处理与编辑，提高图像的反差、清晰度，对图像进行差、清晰度，对图像进行(jnxng)必要的修饰；必要的修饰； 2：图像保存；：图像保存； 3：图像测量。：图像测量。图像信号采集(cij)

9、系统的应用第23页/共109页第二十四页，共110页。二.图像分析的具体应用(yngyng)一-定量分析 1: 1: 组织化学定量组织化学定量 核酸定量：核酸定量：Feulgen Feulgen 法特异对法特异对DNADNA染色染色(rns)(rns)， 天青天青B B法特异对法特异对RNARNA染色染色(rns) (rns) 总蛋白定量：考马斯亮兰总蛋白定量：考马斯亮兰, , 萘酚黄萘酚黄s s 组蛋白：固绿组蛋白：固绿 多糖和糖原：多糖和糖原：PASPAS反应反应 酶类定量：碱性磷酸酶、酸性磷酸酶酶类定量：碱性磷酸酶、酸性磷酸酶图像信号采集系统(xtng)的应用第24页/共109页第二十五

10、页，共110页。2:2:免疫组化定量免疫组化定量 某种特定某种特定(tdng)(tdng)蛋白的定量蛋白的定量, , 受体配体的结受体配体的结合合, , 抗原抗体的结合抗原抗体的结合3:3:原位杂交原位杂交 图像(t xin)信号采集系统的应用第25页/共109页第二十六页，共110页。几何测量：面积，长度，直径(zhjng)，周长等；区域测量：数目，面积百分比等；灰度测量：灰度值，光密度，积分光密度，透射率。 三.图像分析的具体应用(yngyng)二-图像测量图像(t xin)信号采集系统的应用第26页/共109页第二十七页，共110页。 （1）灰度值与物质的浓度成反比，灰度值越高反映为阳性

11、表达率越低，灰度值越低则阳性率越高。 （2）光密度与物质的浓度成正比，光密度值的大小代表染色的深浅，反映物质的相对浓度。 （3）积分光密度为构成被测对像的所有像素点的光密度的和。其与物质的质量(zhling)成正比，积分光密度值的大小代表被染色物质的多少，反映物质的相对含量。 （4）平均透射率反映物体的透光性，亮意味着透光多，暗意味着透光少，光被吸收的多。灰度测量参数(cnsh)的意义第27页/共109页第二十八页，共110页。第28页/共109页第二十九页，共110页。第29页/共109页第三十页，共110页。第四章第四章 细胞培养技术细胞培养技术(jsh)第30页/共109页第三十一页，共

12、110页。主要主要(zhyo)内容内容基本概念基本操作检测(jin c)方法注意事项第31页/共109页第三十二页，共110页。 细胞系(cell line)：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。细胞株(cell strain)：通过克隆形成法或选择法从原代培养物细胞系 中获得的具有特殊性质或标志的培养物成为细胞株。ATCC(American Type Culture Collection）库：美国(mi u)标准培养物库。 基本概念基本概念第32页/共109页第三十三页，共110页。基本概念基本概念第33页/共109页第三十四页，共110页。基本操作基本操作原代培养：从供体取得组织细胞后在

13、体外进行原代培养：从供体取得组织细胞后在体外进行(jnxng)的首次培养。的首次培养。原代培养(piyng)组织(zzh)块培养法消化培养法器官培养法第34页/共109页第三十五页，共110页。基本操作基本操作传代方法传代方法(fngf)：细胞长满培养瓶：细胞长满培养瓶70-80%时即可传代时即可传代悬浮(xunf)细胞直接直接(zhji)传代传代离心传代离心传代贴壁细胞弃去原培养液加胰酶消化终止消化离 心重悬后传代第35页/共109页第三十六页，共110页。第36页/共109页第三十七页，共110页。人原髓细胞(xbo)白血病HL-20细胞(xbo)人肝癌(n i)HepG2细胞第37页/共

14、109页第三十八页，共110页。基本操作基本操作冻存与复苏冻存与复苏(f s)4 10 分钟分钟- -20 30 分钟分钟- -80 16 - 18 小时小时(xiosh)(或隔夜或隔夜) - 液氮槽液氮槽vapor phase 长期储存。长期储存。 冻存程序冻存程序(chngx)原原 则：则：慢冻速溶慢冻速溶第38页/共109页第三十九页，共110页。培养(piyng)瓶第39页/共109页第四十页，共110页。培 养 板第40页/共109页第四十一页，共110页。n 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去(ch q)空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台

15、面，使工作台内构成无菌环境。 超净台第41页/共109页第四十二页，共110页。nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定期消毒。n箱内灭菌蒸馏水3000毫升(ho shn)蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。 CO2培养箱第42页/共109页第四十三页，共110页。滤 器第43页/共109页第四十四页，共110页。第44页/共109页第四十五页，共110页。纯水仪纯水仪第45页/共109页第四十六页，共110页。细胞细胞(xbo)计数计数: 血球计数板计数法血球

16、计数板计数法 细胞数/mL=(4个格子细胞总和/4)x104(每一大格子长，宽均为1mm,深0.1mm,故每个大格子体积为0.1mm3,可容纳 0.1ul,那么(n me)每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大格子细胞数的10000倍。）基本操作基本操作第46页/共109页第四十七页，共110页。细胞检测(jin c)方法 细胞细胞(xbo)活力的检测活力的检测 台盼蓝染色法台盼蓝染色法 MTT法法第47页/共109页第四十八页，共110页。细胞(xbo)检测方法第48页/共109页第四十九页，共110页。细胞(xbo)检测方法第49页/共109页第五十页，共110页。 MTT操作步骤 （1）

17、单细胞悬液接种于96孔培养板；1x105细胞/孔，每孔培养基总量200uL，37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入MTT，20uL孔；继续培养3- 4小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液，150uL孔，将培养板置于微孔板扳荡器上振荡(zhndng)10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长490nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线。细胞(xbo)检测方法第50页/共109页第五十一页，共110页。4. 检测前，要震荡摇匀。第51页/共109页第五十二页，共110页。 细胞周期的检测细胞周期的检测(jin c) PI单染法单染法(流

18、式细胞仪流式细胞仪)细胞检测(jin c)方法第52页/共109页第五十三页，共110页。 PI单染色法单染色法 (1) 离心收集细胞（离心收集细胞（15）106 ，1000rpm,5min,弃弃去上清液；去上清液； (2)PBS洗涤洗涤2次次x5min； (3)离心去离心去PBS，用预冷的，用预冷的70%酒精固定，酒精固定，4过夜；过夜； (4)离心去酒精，离心去酒精，PBS洗涤洗涤2次次x5min； (5)加加PI染液染液100L，4 避光避光(b un)染色染色30min； (6)上流式细胞仪检测，并用随机软件分析。上流式细胞仪检测，并用随机软件分析。 细胞(xbo)检测方法第53页/共

19、109页第五十四页，共110页。细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 PI单染法单染法(流式细胞仪流式细胞仪)； Annexin-V/PI双染法双染法 (流式细胞仪，共流式细胞仪，共聚焦显微镜聚焦显微镜)； TUNEL试剂盒；试剂盒； DNA Ladder； 电镜检测凋亡小体；电镜检测凋亡小体； 凋亡相关凋亡相关(xinggun)蛋白的检测：如蛋白的检测：如：Bcl-2, Bax, Caspase-3等。可用免疫组化等。可用免疫组化法；流式细胞仪；共聚焦显微镜；法；流式细胞仪；共聚焦显微镜；Western blot.细胞检测(jin c)方法第54页/共109页第五十五页，共110页。Annexin-

20、V/PI双染法双染法 标记的标记的Annexin-V检测细胞外膜上的磷脂酰丝氨酸；检测细胞外膜上的磷脂酰丝氨酸；PI可以结合可以结合(jih)死亡或凋亡细胞死亡或凋亡细胞DNA。 (1)离心收集细胞，用离心收集细胞，用4预冷的预冷的PBS洗涤，洗涤，1000rpm,2x5min； (2)用用250l结合结合(jih)缓冲液重悬细胞，并使其浓度缓冲液重悬细胞，并使其浓度为为 1106 /mL； (3)取取100 l细胞悬液于细胞悬液于5mL流式管中，加入流式管中，加入5 lAnnexin-v和和10 l的的PI溶液，室温避光染色溶液，室温避光染色15min ； (4)在反应管中加入在反应管中加入

21、400 lPBS，流式细胞仪分析。，流式细胞仪分析。细胞(xbo)检测方法第55页/共109页第五十六页，共110页。第56页/共109页第五十七页，共110页。细胞(xbo)检测方法细胞内离子浓度的检测(jin c) 如：钙离子(流式细胞仪，激光共聚焦显微镜）细胞膜离子通道的检测(jin c) 如：钾离子通道；钠离子通道(膜片钳)细胞内自由基的检测(jin c) SOD,MDA检测(jin c)试剂盒；激光共聚焦显微镜细胞膜或线粒体膜电位的检测(jin c) 流式细胞仪，激光共聚焦显微镜第57页/共109页第五十八页，共110页。细胞内细胞内SOD检测检测(jin c)（DCFH-DA标记）

22、标记）第58页/共109页第五十九页，共110页。v保证细胞生长环境与操作环境的无菌。保证细胞生长环境与操作环境的无菌。v细胞传代时间与实验用细胞均应处于对数生长期。细胞传代时间与实验用细胞均应处于对数生长期。v尽可能保证培养细胞用的培养基或血清为同一批次的。尽可能保证培养细胞用的培养基或血清为同一批次的。v血清，胰蛋白酶血清，胰蛋白酶(y dn bi mi)应分装保存，避免反复冻融。应分装保存，避免反复冻融。v血清首次用前要热灭活补体（血清首次用前要热灭活补体（56水浴，水浴，30min)。v细胞冻存与复苏的原则：慢冻速溶。细胞冻存与复苏的原则：慢冻速溶。v血清中不仅存在促细胞生长因子，同对

23、也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。故培养用血清浓度不宜过高。血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。故培养用血清浓度不宜过高。细胞培养中应注意(zh y)的问题第59页/共109页第六十页，共110页。 第五章 流式细胞仪在 医学研究(ynji)中的作用第60页/共109页第六十一页，共110页。主要(zhyo)内容 流式细胞仪原理(yunl) 流式细胞仪的应用 注意事项第61页/共109页第六十二页，共11

24、0页。流式细胞仪原理(yunl) 概念 流式细胞术是世纪年代发展起来的一种快速对 单细胞进行定量分析和分选的新技术 。如测量细胞的物理 或化学性质,如大小、内部结构、蛋白质、 抗原等,并可对其分类收集。 流式细胞仪结合了三大体系：流体力学(li t l xu)，光学，及电子 学。随着单克隆抗体技术、荧光染料技术等多学科新技术高 度发展,它在生物医学领域的应用越来越广泛。第62页/共109页第六十三页，共110页。流式细胞仪原理(yunl)第63页/共109页第六十四页，共110页。DOT PLOT第64页/共109页第六十五页，共110页。流式细胞仪原理(yunl)光的散射信号在流式细胞仪是非

25、常有价值的信息： FSC(前向散射光或小角度散射)：细胞相对大小； SSC(侧向散射光或大角散射)：细胞颗粒度及内部精细结构的特性； FL1,FL2,FL3,FL4,等：不同的荧光(ynggung)波段。 散射光和荧光(ynggung)信号接收后经转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光(ynggung)染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光(ynggung)染料,可同时测定一个细胞上的多种不同的特征,如细胞大小、含量、细胞表面抗原表达、癌基因蛋白等等。第65页/共109页第六十六页，共110页。流式细胞仪的应用(yngyng) 免疫学中的应用 常用于免疫细胞

26、的分类、分型,而且还能再进一步区分各系的亚群。例如用抗4、8、3、56、16的单克隆抗体可以将淋巴细胞分为辅助细胞亚群，抑制细胞亚群，并区分出自然杀伤细胞()，然后通过对、和细胞水平的测定，检测机体(jt)的免疫状态。第66页/共109页第六十七页，共110页。 血液学中的应用 对恶性血液病尤其是白血病可进行分类，另外它通过(tnggu)对细胞周期相关的参数与恶性细胞相关表面抗原标志同时测定，可以了解这种细胞的动力学特点和恶性细胞的来源，以期达到个体化化疗的目的。流式细胞仪的应用(yngyng)第67页/共109页第六十八页，共110页。流式细胞仪的应用(yngyng) 肿瘤研究中的应用 流式

27、细胞仪的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃， 用于测定细胞含量，分辨率高,精确，可为判断肿瘤的生物学行为提供客观(kgun)而准确的资料，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。非整倍体的出现是癌前病变发生早期癌变的一个重要指标。淋巴瘤、白血病的早期阶段不像上皮性肿瘤的癌变或癌变早期具有一定组织上的特征，但应用流式细胞仪可测得正常细胞和异常细胞含量的微小差别。第68页/共109页第六十九页，共110页。 标本(biobn)来源 血液、尿液、细胞培养液、胸水、腹水、灌洗液、新鲜实体瘤及活检组织标本(biobn)、石蜡固定标本(biobn)等。第69页/共109页第七十页，共110页。注意事项注意事项1 细胞

28、数量要求达到一定的数目，一般在105-107 ；贴壁细胞的收集过程中要注意不能消化过久，以防碎片过多；细胞固定时要充分打散，以防出现细胞块，堵塞机器喷嘴；如连续测量多个时间点的样品(yngpn)，可将固定好的样品(yngpn)置于 -20，最后一个时间点一起染色上机检测。第70页/共109页第七十一页，共110页。第71页/共109页第七十二页，共110页。第六章 激光(jgung)扫描共聚焦显微镜第72页/共109页第七十三页，共110页。主要(zhyo)内容 激光扫描共聚焦(jjio)显微镜原理 共聚焦(jjio)显微镜与普通显微镜的不同 共聚焦(jjio)显微镜的应用第73页/共109页

29、第七十四页，共110页。激光(jgung)共聚焦显微镜的原理 Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共

30、轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴轴的不断移动，就可得到的不

31、断移动，就可得到(d do)样品不同层面连续的光切图像样品不同层面连续的光切图像 。第74页/共109页第七十五页，共110页。激光共聚焦(jjio)显微镜的原理激光共聚焦(jjio)显微镜原理示意图第75页/共109页第七十六页，共110页。共聚焦(jjio)显微镜与普通显微镜的不同抑制图像的模糊抑制图像的模糊(m hu)，获得清晰的图像，获得清晰的图像具有更高的轴向分辨率，并可获取连续具有更高的轴向分辨率，并可获取连续(linx)光学切片光学切片增加侧向分辨率增加侧向分辨率由于点对点扫描去除了杂散光的影响由于点对点扫描去除了杂散光的影响第76页/共109页第七十七页，共110页。1.多荧光

32、标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集2.无损伤、连续无损伤、连续(linx)光学切片，显微光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组真正的三维重组4.假三维图的显示假三维图的显示5.可沿可沿Z轴（轴（xy平面）和平面）和Y轴（轴（xz平面）方向进行光切平面）方向进行光切6.定量分析定量分析7.时间序列扫描时间序列扫描: xyt 、xyzt 和和 xt 扫描扫描8.图像处理图像处理9. 旋转扫描旋转扫描10.感兴趣区域扫描感兴趣区域扫描11.光谱扫描光谱扫描 激光(jgung)共聚焦的功能第77页/共109页第七十八页，共110页。激光共聚焦(jjio)的

33、应用 定位、定量定位、定量 三维重组三维重组(zhn z) 动态测量动态测量 活细胞或组织内游离活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化分布和浓度的变化 测量（测量（Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的检测自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位蛋白质的转位第78页/共109页第七十九页，共110页。活细胞内活细胞内H+浓度浓度(nngd)（ pH值）的测值）的测量量线粒体膜电位的测量线粒体膜电位的测量其他应用其他应用激光共聚焦(jjio)的应用第79页/共109页第八十页，共110页。一、具体应用一一、具体应用一-

34、定位、定量定位、定量免疫荧光标记（单标、双标或三免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量：标）的定位、定量：如：如： 细胞膜受体或抗原细胞膜受体或抗原(kngyun)的分布，微丝、的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共定位、蛋白与细微管的分布、两种或三种蛋白的共定位、蛋白与细胞器的共定位，核转录因子转位和干细胞的增殖、胞器的共定位，核转录因子转位和干细胞的增殖、分化。分化。细胞凋亡细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位杂交末端原位杂交-fitc + PI荧光原位杂交：荧光原位杂交： 染色体基因定位染色体基因定位 激光(jgung)共聚焦的应用第80页/共109页

35、第八十一页，共110页。二：具体(jt)应用二-标记细胞器 线粒体 溶酶体 高尔基体 内质网 细胞核激光(jgung)共聚焦的应用第81页/共109页第八十二页，共110页。三三.具体应用具体应用-动态动态(dngti)测量测量 细胞内离子动态细胞内离子动态(dngti)变化测量变化测量 1) 游离游离Ca2+测量测量 2）药物进入细胞的动态）药物进入细胞的动态(dngti)过程过程及定位分布及定位分布 xyzt 扫描扫描激光共聚焦(jjio)的应用第82页/共109页第八十三页，共110页。第七章第七章 Western Blot第83页/共109页第八十四页，共110页。主要主要(zhyo)

36、内容内容 基本基本(jbn)知识点知识点 主要操作步骤主要操作步骤 注意事项注意事项第84页/共109页第八十五页，共110页。基本基本(jbn)知识点知识点 SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变 ，这样SDS-蛋白 质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷 和形状的影响，而只与蛋白质的分子(fnz)量有关。由于SDS和DTT的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子(fnz)量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯 酰胺的浓度和交联度。 第85页/共109页第八十六页，共110页。SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效

37、分离(fnl)范围*丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD） 1512431016687.536945.057212*双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔(m r)比为 1：29。基本基本(jbn)知识点知识点第86页/共109页第八十七页，共110页。主要(zhyo)操作步骤蛋白质分离蛋白质分离(fnl)(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳)转转 膜膜免免 疫疫 染染 色色(抗原抗原(kngyun)-抗体反应抗体反应)第87页/共109页第八十八页，共110页。主要主要(zhyo)操作步骤操作步骤蛋白质的分离蛋白质的分离(fnl)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳注意注意(zh y)：

38、每孔上样蛋白质的总量应一致；每孔上样蛋白质的总量应一致； 上样体积不超过上样体积不超过20l。 第88页/共109页第八十九页，共110页。滤 纸滤 纸胶胶膜膜主要主要(zhyo)操作步骤操作步骤转转 膜（半干法）膜（半干法）第89页/共109页第九十页，共110页。主要主要(zhyo)操作步骤操作步骤免疫免疫(miny)显色显色封闭(fngb) 一抗 二抗 显色 干燥保存第90页/共109页第九十一页，共110页。注意事项注意事项1：膜胶滤纸；短路的原因是上下滤纸有接触，只要避免：膜胶滤纸；短路的原因是上下滤纸有接触，只要避免接触就行。滤纸在转移接触就行。滤纸在转移(zhuny)缓冲液中湿润

39、时会扩大，这点在裁剪缓冲液中湿润时会扩大，这点在裁剪滤纸时应考虑到。滤纸时应考虑到。 2：胶浓度的选择，电压与电流的选择应根据蛋白质分子量的：胶浓度的选择，电压与电流的选择应根据蛋白质分子量的大小和膜面积而定。凝胶上所加电压为大小和膜面积而定。凝胶上所加电压为8V/cm 2。3：要标记内参照（：要标记内参照（GAPDH或或-actin)4：转膜与封闭要排除气泡；整个操作过程应戴手套。：转膜与封闭要排除气泡；整个操作过程应戴手套。第91页/共109页第九十二页，共110页。第八章 膜片钳第92页/共109页第九十三页，共110页。主要(zhyo)内容v膜片钳的原理(yunl)v膜片钳的应用第93

40、页/共109页第九十四页，共110页。膜片钳的概念(ginin) 1976年由德国生理学家Nehetr和Sakmann建立的膜片钳技术是一种(y zhn)以记录过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的(或数个)离子通道活动的技术“它为从分子水平了解生物膜离子通道的门控动力学特征及通透性和选择性等膜信息,提供了最直接的手段。 作为先进的细胞电生理技术,膜片钳一直(yzh)被奉为研究离子通道的金标准。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性，分子结构，药物作用机制等进行深入的研究。第94页/共109页第九十五页，共110页。 该技术可将一尖端经加热抛光的玻璃微电极吸管吸附一片只

41、有几平方微米的细胞膜,形成吸管内外近似电密封。再在吸管内施以负压,使微电极尖端与记录的细胞膜片表面形成封接,因而可通过微电极直接对膜片进行电压钳制,无需使用其它微电极。 膜片钳技术对膜电压的钳制是通过负反馈回路而实现的。这种负反馈电路要求细胞膜电位在所有时间都与经放大器输出的指令电压相等。当由于离子通道的开放造成膜电位与指令电位之间发生(fshng)差异时,微电极放大器就通过记录电极向胞内自动注入大小相等和方向相反的电流而使膜电位得以钳制，通过记录放大器用以维持细胞膜钳制电位所输出的电流大小,即可推算出由于离子通道开放所产生的电流大小,以及由此导致的膜电导的改变。 膜片钳原理(yunl)第95

42、页/共109页第九十六页，共110页。膜片钳主要(zhyo)功能 直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程； 区分离子通道的离子选择性； 能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础(jch)上进一步计算 出细胞膜上的通道数和开放概率；第96页/共109页第九十七页，共110页。膜片钳的主要(zhyo)应用1.细胞膜离子通道的性质鉴定及其动力学研究；2.研究细胞分泌：其原理在于细胞分泌的胞吐过程是在细胞膜上进行的,它会引起细胞形态的改变和物质流动,从而导致膜片参数发生变化。尤其是伴随着分泌活性,整个细胞表面积(与膜电容比较)必然增加,通过测量细胞膜电容,便可估计单细胞分泌活性；3.研究信号转导；4.研

43、究新的离子通道；5.分子生物学研究：膜片钳技术也是研究转运蛋白基因克隆、表达(biod)和功能分析的有效手段；6.金属离子作用于细胞膜行为的研究：主要应用于植物学，研究稀土元素对植物 的影响；7.其他应用。第97页/共109页第九十八页，共110页。第九章 Real-Time PCR第98页/共109页第九十九页，共110页。主要主要(zhyo)内容内容v 原原 理理v 基本概念基本概念v 优优 点点v 常用的探针常用的探针(tn zhn)种类种类第99页/共109页第一百页，共110页。原原 理理 RT-PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来及时测定特异性产物的量，并据此判断目的基因的初始(ch sh)量。 其应用探针的基本原理就是根据荧光共振能量转移现象(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)设计的。当一个荧光分子(供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰竭，这种现象即是FRET。随着距离的延长，FRET现象减弱。 第100页/共109页第一百零一页，共110页。基本概念基本概念(1) Ct值：又称循环域值，表示在值：又称循环域值，表示在PCR循环中，最先循环中，最先(2) 监测到的高于