山东大学研究生国家精品课程_PCR原理及应用

1、 聚合酶链反应Polymerase chain reaction（PCR） 山东大学医学院 免疫学研究所 王晓燕 概概 述述 聚合酶链反应（PCR）是一种在体外扩增特定基因或DNA序列的方法，又称基因体外扩增法，具有特异性、高效性和高度准确性三大特点。发展简史常规多聚酶链反应常用的几种PCR技术PCR的应用一、发展简史一、发展简史1985年：美国PE-Cetus公司的Mullis首次发明了PCR技术，采用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段1988年初：Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR反应1988年：Sarki 利用从水生嗜热杆菌（Thermus aquaticus)

2、中提取的耐热DNA多聚酶-TaqDNA多聚酶进行PCR研究二、常规多聚酶链反应二、常规多聚酶链反应（一）基本原理：（一）基本原理： PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA片段得以迅速扩增。 变性-退火-延伸-延伸 25-30循环 94-95 55左右 72 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：dsDNA ssDNA 模板DNA与引物的退火(复性)：引物与模板DNA的互补序列配对结合引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与

3、半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链新链又可成为下次循环的模板, 经2-3h可将待扩目的基因扩增放大几百万倍5353变性变性退火退火延伸延伸第二循环第二循环dsDNAssDNA加入引物加入引物5335dNTP, Tag酶酶535533355555PCR反应的DNA扩增量呈指数上升, 最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，则 Y2n 。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止

4、期，即出现“停滞效应” 。PCR产物计算产物计算产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，即待扩增的特定片段。以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸， 其5端是固定的，这种新生链作为模板时，由于5端序列固定，就等于再次延伸片段的3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的产物。产物的特点产物的特点特异性强：特异性强：由引物与模板DNA的特异性结合、碱基配对原则、Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性及靶基因的特异性与保守性决定灵敏度高灵敏度高：皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平操作简单，省时操作简单，省

5、时：1-2 h对原始材料质量要求较低对原始材料质量要求较低有一定程度的单核苷酸错误掺入有一定程度的单核苷酸错误掺入（二）（二）PCR的特点的特点（三）（三）参与参与PCR反应的成分反应的成分模板：可为DNA或RNA，哺乳动物基因组DNA模板量为0.1-1g引物：0.1-0.5 mol/L缓冲液：10-50mmol/L Tris-HCl（PH8.3-8.8）Mg2+浓度：1.5-2 mmol/L dNTP：单核苷酸浓度50-200 mol/LTaqDNA聚合酶：100l 反应液中加入1-2.5U 的TaqDNA聚合酶dNTP的质量与浓度的质量与浓度dNTP溶液呈酸性，pH7.07.5，小量分装，

6、 -20冰冻保存。dNTP浓度：50200umol/L。4种dNTP要等摩尔配制，如其中任何一种浓度偏高或偏低，就会引起错配。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。PCR引物的设计原则引物的设计原则上游引物上游引物与目的DNA端序列完全相同； 下游引物下游引物与目的DNA端序列互补引物长度以15-30个碱基为宜；引物碱基尽可能随机分布，G+C含量为40-60避免引物内形成二级结构，尤其是发夹结构两引物间不应发生互补，特别是在端，避免形成引物二聚体 两引物间不应有同源序列，与模板DNA的其它序列也不应有同源序列引物的3末端碱基原则上要求与模板DNA一定要配对合成的引物应进行纯化引物

7、的浓度不要太高: 0.1-0.5 mol/L引物的5末端可以进行修饰引物的设计范例引物的设计范例目的DNA：ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3上游序列： ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC G+C=11/21=52%下游序列：CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3 G+C=10/21=48%（四）（四）PCR反应的条件反应的条件预变性：94 3min左右变性温度与时间：94-95 30s-1min复性（退火）温度与时间：温度低于Tm值5 Tm=

8、4（G+C）+2（A+C） 通常温度为55-60，时间为30s-1min延伸温度与时间：72 30s-1min循环数：25-30最后延伸72 5min（五）（五）PCR扩增产物的分析扩增产物的分析凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变核酸序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法 三、常用的几种三、常用的几种PCR反应反应（一）（一）反转录反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR)反转录PCR： mRNA-cDNA-PCR抽提RNA 反转录合成cDNAPC

9、R 扩增AAAAAAA-3 TTTTTTT-5mRNAcDNATTTTTTT-5PCRRT-PCR的基本原理反转录酶（AMV）+ dNTPcDNA AAAAAAAAMV：鸟类成髓细胞白血病病毒MMLV: 莫洛尼鼠类白血病病毒 （二）（二）实时荧光定量实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescence Quantitative PCR) 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定

10、量实时荧光定量PCR 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义值的定义C代表Cycle（循环数）t代表threshold（荧光域值）Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数Ct值的确定值的确定横坐标：PCR循环数纵坐标：荧光信号强度黑线：荧光域值红线：无模板 -域值下一直线绿线 ：样品Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值） 2. 设定荧光域值（设定荧光域值（threshold） PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光

11、本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍， 即：threshold = 10SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线荧光定量标准曲线荧光定量标准曲线横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值.获得未知样品的Ct值-标准曲线-该样品的起始拷贝数。 4. PCR过程的监测过程的监测监测PCR过程的方法可分为两种：荧光探针监测uTaqMan探针u分子信标探针uLightcycler探针荧光染料监测uS

12、YBR绿色荧光染料（1）TaqMan荧光探针荧光探针TaqMan 荧光探针工作原理荧光探针工作原理用荧光基团标记PCR特异性荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 -检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离-荧光监测系统接收到荧光信号每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqMan 荧光探针的荧光探针的缺点缺点采用荧光淬灭及双末端标记技术，因此淬灭难以彻底，本底较高。采用酶外切活性，因此定量时受酶性能影响。探针标

13、记成本较高，不便普及应用。 （2）分子信标探针）分子信标探针 在探针的两末端分别标记荧光基团和淬灭基团，与TaqMan探针不同的是，该探针5和3末端自身可形成8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构，溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中探针的量成正比，因此可用于PCR定量分析。分子信标技术结合不同荧光标记可用于基因多突变位点同时分析。 （3）Lightcycler 双双探针探针由Roche公司开发的一种新的PCR定量技术该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生荧光探针和淬灭探

14、针，荧光探针的3端连接荧光基团；淬灭探针的5端连接淬灭基团。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光基团和淬灭基团紧密相邻形成发夹结构而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成正比，以此可以进行PCR定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上因此影响扩增效率，此外由于需要合成两个较长的探针，因此合成成本相对较高。（4）SYBR荧光染料荧光染料 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料；SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。（

15、三）原位（三）原位PCR技术技术 （Insitu PCR）由Hasse等于1990年建立的，是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。原位PCR技术是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术，实验用的标本可以是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。原位原位PCR的基本方法的基本方法固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活细胞内源性过氧化物酶。蛋白酶K消化处理:用蛋白酶K将固定好的组织细胞片消化处理，并于96灭活蛋白酶K。PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡

16、后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增。杂交:用标记的寡核苷酸探针与PCR扩增产物进行原位杂交。显微镜观察结果原位原位PCR的特点的特点原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置。应用于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理转归。特异性和敏感性高于一般的PCR。 （四）反向（四）反向PCR （Reverse PCR) 反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将

17、含有两引物外未知序列，从而对未知序列进行分析研究。 （五）不对称（五）不对称PCR (Asymmetric PCR）不对称PCR (asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA) 。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50100 1。在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。特点：需多次摸索优化两条引物的比例主要用于核酸序列测定 （六）重组（六）重组PCR （Recombinant PCR）使两个不相邻的

18、DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR(recombinant PCR) 。Mullis等于1986年报道。其基本原理为将突变碱基，插入或缺失片段，或一种物质的几个基因片段均设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增，其产物将是一重组合的DNA。主要用于位点专一碱基置换，DNA片段的插入或缺失，DNA片段的连接。 （七）多重（七）多重PCR （Multiplex PCR）多重PCR (multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应

19、试剂和操作过程与一般PCR相同。特点: 高效性 系统性 经济简便性多重多重PCR的应用的应用多种病原微生物的同时检测或鉴定：肝炎病毒的感染、肠道致病性细菌的检测、性病的检测、战伤细菌及生物战剂细菌的检测，需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等。病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等。 （八）（八）免疫免疫-PCR （Immuno-PCR）免疫-PCR (Immuno-PCR)是一种灵敏、特异的抗原检测系统，利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适

20、用于极微量抗原的检测。优点: 特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上。 敏感度高，可用于单个抗原的检测。 操作简便 利用梯度PCR仪对解链、退火及延伸设置温度梯度，适用于摸索试验条件时，多次试验可在一台仪器上完成，既节省试验时间，提高效率，又节省试验成本。（九）梯度（九）梯度PCR （Gradient PCR ） （十）巢式十）巢式PCR （Nested PCR） 巢式PCR（nested PCR）是一种PCR改良模式，它使用巢式PCR引物来增强反应的敏感性和特异性，巢式PCR方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对外引物产生扩增产物，然后用一对内引物对

21、第一轮扩增产物进行第二轮扩增。以上方法适用于多种DNA及RNA病毒的检测，如HBVDNA、HCV RNA、HIVRNA等。四、四、PCR的应用的应用（一）在分子生物学中的应用（一）在分子生物学中的应用1、制备cDNA文库与筛选2、DNA测序3、基因克隆4、检测突变碱基（PCR-SSCP）PCR-SSCP单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析其基本过程是:PCR扩增靶DNA;将特异的PCR扩增产物变性后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;最后通过放射性自显影、

22、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。简便、快速、灵敏用于检测和肿瘤发生有关的基因突变（点突变）和短序列的缺失、插入用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究中用于DNA定量分析监测PCR诊断实验中的交叉污染情况（二）在临床医学中的应用（二）在临床医学中的应用 1、病原体检测对于外源入侵的病原体，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物或探针，用PCR、RT-PCR或杂交方法来检测，其范围包括细菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。 PCR诊断的特点是可以选择其基因中的保守区作通用检测，也可以选定差异较大的基因部位作分型检测。既可以做一病原体的专用检测，也可以将