第6章 核酸的分离与纯化

1、 导言导言 核酸分离与纯化是研究核酸核酸分离与纯化是研究核酸性质与功能的基础，核酸样品的性质与功能的基础，核酸样品的制备质量直接影响到核酸的研究制备质量直接影响到核酸的研究与应用。与应用。 核酸核酸(nucleic acid)(nucleic acid)：包括包括DNADNA与与RNARNA两类分子。两类分子。真核生物的真核生物的DNADNA：染色体染色体DNADNA与细胞器与细胞器DNADNA。 真核生物细胞内的核酸均与蛋白质结合成真核生物细胞内的核酸均与蛋白质结合成核蛋白核蛋白(nucleoprotein)(nucleoprotein)。 DNADNA与蛋白质结合：脱氧核糖核蛋白与蛋白质结

2、合：脱氧核糖核蛋白 RNARNA与蛋白质结合：核糖核蛋白与蛋白质结合：核糖核蛋白原核生物的原核生物的DNADNA：双链环状双链环状DNA(DNA(包括质粒包括质粒DNADNA） 非细胞型的病毒颗粒非细胞型的病毒颗粒DNADNA：双链环状、单链环双链环状、单链环状、双链线状和单链线状。状、双链线状和单链线状。 RNARNA： 由于由于RNA的功能是多样性的，因的功能是多样性的，因此此RNA的种类、大小和结构都具有多样化。的种类、大小和结构都具有多样化。 DNA与与RNA性质上的差异决定了两性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不同的。者的最适分离与纯化的条件是不同的。 ( (一一) )材

3、料与方法的选择材料与方法的选择 如何恰当地收集与准备材料，选择适如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。 临床常见的标本：临床常见的标本： 有血液、尿液、唾液、组织及培养细有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等，有些标本是新鲜的，有些标本是陈胞等，有些标本是新鲜的，有些标本是陈旧的。旧的。 ( (二二) )选择原则：选择原则： 1 1、保证核酸一级结构的完整性，是核酸结、保证核酸一级结构的完整性，是核酸结构和功能研究最基本要求。构和功能研究最基本要求。2 2、尽量排除其它分子的污染，保证核酸样、尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的

4、纯度。品的纯度。 （三）影响核酸完整性的因素（三）影响核酸完整性的因素 影响核酸完整性的因素很多，包括物理、影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学因素。化学与生物学因素。 可以避免的有害因素：可以避免的有害因素： 避免过酸、过碱、高温加热避免过酸、过碱、高温加热 无法避免的有害因素无法避免的有害因素 ： 1 1、缩短有害因素对核酸的作用时间；、缩短有害因素对核酸的作用时间； 2 2、抑制核酸酶的活性。、抑制核酸酶的活性。 在不影响核酸质量的情况下，应选择安全在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。无毒的试剂与方案。 (一一)核酸的释放核酸的释放 机械法：机械法： 液体剪

5、切法液体剪切法 固体剪切法固体剪切法 非机械法：非机械法： 干燥法干燥法 溶胞法溶胞法 (二二)核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化 利用核酸与其它物质在一个或利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异设计有效方案，多个性质上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分离。才能使核酸得以分离。 核酸与其它物质的差异核酸与其它物质的差异 1、细胞定位与组织分布上的差异；、细胞定位与组织分布上的差异；2、物理化学性质上的不同；、物理化学性质上的不同；3、以及各自独特的生物学特性。、以及各自独特的生物学特性。 应该去除的污染物应该去除的污染物 非核酸的大分子污染物；非核酸的大分子污染物；非需要的核酸分子；非需要

6、的核酸分子； 对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。 ( (三三) ) 核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸的浓缩、沉淀与洗涤 常用的方法：常用的方法：有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法原原 理：理： 核酸可与钾、钠，镁等阳离子形成盐，屏蔽核酸可与钾、钠，镁等阳离子形成盐，屏蔽带负电的磷酸基团，使带负电的磷酸基团，使DNADNA分子聚结在一起而不分子聚结在一起而不溶于许多有机溶剂。溶于许多有机溶剂。 常在加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉常在加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。淀核酸。 常用的盐类：常用的盐类： 有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化有醋酸钠、醋酸钾、醋

7、酸铵、氯化钠、氯化钾及氧化镁等。钾及氧化镁等。 常用的有机溶剂：常用的有机溶剂：有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。 ( (一一) )核酸的鉴定核酸的鉴定 1 1浓度鉴定浓度鉴定 (1)(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法： (2)(2)荧光光度法：荧光光度法： 2 2纯度鉴定纯度鉴定 (1)(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法： (2)(2)荧光光度法：荧光光度法： 3 3完整性鉴定完整性鉴定 (1)(1)凝胶电泳法：凝胶电泳法： (2)(2)其它方法：（略）其它方法：（略）(二二)核酸的保存核酸的保存-DNA的保存的保存 TE缓冲液：缓冲液： 可以减少可以减少DNA的脱氨反

8、应。的脱氨反应。EDTA： 通过螯合通过螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子可以抑等二价金属离子可以抑制制DNA酶的活性。酶的活性。低温条件：低温条件：在4oC条件下可保存较长时间。氯仿：氯仿： 在在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。免细菌与核酸的污染。 (二二)核酸的保存核酸的保存-RNA的保存的保存 RNA可溶于可溶于0.3molL的醋酸钠溶液的醋酸钠溶液或双蒸水中，在或双蒸水中，在-70oC至至-80oC保存。保存。 1、抑制、抑制RNA酶对酶对RNA的降解；的降解； 2、有机溶剂的加入。、有机溶剂的加入。注意：注意： RNA酶抑制剂或

9、有机溶剂的加入酶抑制剂或有机溶剂的加入只是一种暂时保存的需要，如果它们对后只是一种暂时保存的需要，如果它们对后继的实验与应用有影响，则应予以去除。继的实验与应用有影响，则应予以去除。 核酸小量分装保存：核酸小量分装保存： 由于反复冻融产生的机械剪切力由于反复冻融产生的机械剪切力对对DNA与与RNA核酸样品均有破坏作核酸样品均有破坏作用，在实际操作中，最好将核酸小量用，在实际操作中，最好将核酸小量分装保存。分装保存。 第二节第二节 基因组基因组DNA的分离与纯化的分离与纯化 一、分离与纯化的方法一、分离与纯化的方法 哺乳动物细胞基因组哺乳动物细胞基因组DNA的提取的提取 (一一)酚抽提法酚抽提法

10、 以含以含EDTA、SDS及无及无DNA酶的酶的RNA酶裂解酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用处理后，用pH8.0的的Tris饱和酚抽提饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品样品 EDTA：为二价金属离子整合剂，可以抑制为二价金属离子整合剂，可以抑制DNA酶的活性，酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。同时降低细胞膜的稳定性。SDS：为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜的降解并能为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质。并使它们沉淀

11、，同时还有降解乳化脂质和蛋白质。并使它们沉淀，同时还有降解DNA酶酶的作用。的作用。无无DNA酶的酶的RNA酶：酶：可以有效水解可以有效水解RNA而避免而避免DNA的消的消化。化。蛋白酶蛋白酶K：有水解蛋白质的作用，可以消化有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶和细胞酶和细胞中的蛋白质。中的蛋白质。酚：可以使蛋白质变性沉淀，也抑制酚：可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性。酶的活性。pH8.0的的Iris溶液：溶液：能保证抽提后能保证抽提后DNA进入水相，而避免进入水相，而避免滞留于蛋白质层。滞留于蛋白质层。 裂解缓冲液：裂解缓冲液： (二二)甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法 甲酰胺解聚法，其中细胞

12、裂解与蛋白质水解甲酰胺解聚法，其中细胞裂解与蛋白质水解步骤同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是步骤同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物与蛋白质的复合物(即染色质即染色质)，然后通过火棉胶袋的充分透析以除，然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。去蛋白酶和有机溶剂。 甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与质与DNA的复合物还可使释放的蛋白质变性，的复合物还可使释放的蛋白质变性，但对蛋白酶但对蛋白酶K的活性无显著影响。的活性无显著影响。 (三三)玻棒缠绕法玻棒缠绕法(四四)其它方法

13、其它方法 异丙醇沉淀法：异丙醇沉淀法： 玻璃珠吸附法：玻璃珠吸附法： 各种方法的取舍、蛋白酶各种方法的取舍、蛋白酶K与与RNA酶的使用与否要根据需要小心选酶的使用与否要根据需要小心选择。择。 碘化钾法抗凝血碘化钾法抗凝血DNADNA提取（遗传中心）提取（遗传中心）取抗凝血取抗凝血500l500l于于1.5ml EP1.5ml EP管（管（4 4管）管）加重蒸水至加重蒸水至1500l1500l8000r/min 8000r/min 离心离心3min3min，弃上清（，弃上清（4 4管白细胞合并）管白细胞合并）加加80l 5mol/L KCl80l 5mol/L KCl，旋涡振荡，旋涡振荡30S3

14、0S加加9g/L NaCl400l9g/L NaCl400l，混匀，混匀加加600l600l氯仿，旋涡振荡氯仿，旋涡振荡30S30S10000r/min10000r/min离心离心5min5min，取上清，取上清400l400l加异丙醇加异丙醇240l240l4 40 0C 10000r/minC 10000r/min离心离心12min12min，弃上清，弃上清 500l 4 500l 4 无水乙醇洗一次无水乙醇洗一次4 40 0C 10000r/minC 10000r/min离心离心55，弃上清，弃上清擦干擦干,37,37干燥干燥2-3min2-3min，80l 180l 1TETE混匀溶解

15、配混匀溶解配备。备。 (五五)DNA样品的进一步纯化样品的进一步纯化 某些限制性内切酶的消化、基因克隆、某些限制性内切酶的消化、基因克隆、转染以及基因组文库的构建等对转染以及基因组文库的构建等对DNA的纯的纯度与完整性要求较高，此时需对度与完整性要求较高，此时需对DNA样品样品作进一步的纯化处理。作进一步的纯化处理。纯化的方法：纯化的方法： 透析、层析、电泳及选择性沉淀等。透析、层析、电泳及选择性沉淀等。 二、二、DNA片段的回收片段的回收 (一一)原则与要求原则与要求 一是要提高一是要提高DNA片段的回收率；片段的回收率； 二是要去除回收二是要去除回收DNA样品中的污染。样品中的污染。(二二

16、)从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收DNA片段片段(三三)从聚丙烯酰胺凝胶中回收从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段片段 三、基因组三、基因组DNA分离纯化的分离纯化的 方法学评价与质量保证方法学评价与质量保证 可行性：可行性：包括方法是否简便、快速、包括方法是否简便、快速、安全及成本如何。安全及成本如何。 可靠性：可靠性：包括方法的稳定性、重复性、包括方法的稳定性、重复性、特异性、产出比、最大产量及最小样特异性、产出比、最大产量及最小样品用量等。品用量等。 第三节第三节 质粒质粒DNA的提取与纯化的提取与纯化 一、提取与纯化方法一、提取与纯化方法 主要由细菌的培养主要由细菌的培养(质粒质粒DN

17、A的扩增的扩增)，细，细菌的裂解菌的裂解(质粒质粒DNA的释放的释放)及质粒及质粒DNA的分离的分离与纯化等三个步骤组成。与纯化等三个步骤组成。 (一一)碱裂解法碱裂解法 (二二)煮沸裂解法煮沸裂解法 (三三)SDS裂解法裂解法 (四四)其它方法其它方法 质粒质粒DNA的纯化的纯化 1CsCL-EB法法 2聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法沉淀法:是一种分级沉淀法。是一种分级沉淀法。 3柱层析法柱层析法 二、质粒二、质粒DNA的回收的回收 常通过凝胶电泳分离并回收。有关回收常通过凝胶电泳分离并回收。有关回收方法与本章第二节中方法与本章第二节中DNA片段的回

18、收方法相片段的回收方法相同。同。 三、质粒三、质粒DNA提取纯化的方法学评价与质量提取纯化的方法学评价与质量保证保证 (一一)方法学评价方法学评价 (二二)质量保证质量保证 第四节第四节 RNA的分离与纯化的分离与纯化 由于各种由于各种rRNA、tRNA及核内小分子及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与疾病诊断的目的出发，目前对隆、表达与疾病诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化主要指总的分离与纯化主要指总RNA与与mRNA的分离与纯化。的分离与纯化。 一、一、RNA制备的条件与环境制备的条件与环境 1、RNA容易被容易被RNase水解：

19、水解：2、排除、排除RNase的污染是的污染是RNA制备成功与否的关键制备成功与否的关键因素：因素： RNase多肽链内二硫键的存在使多肽链内二硫键的存在使RNase的生物的生物活性非常稳定，加热煮沸及一般的变性剂均不能活性非常稳定，加热煮沸及一般的变性剂均不能使其完全失活，而且去除变性剂后，使其完全失活，而且去除变性剂后，RNase的活的活性又可以恢复。性又可以恢复。 RNase的激活与的激活与DNase不同，不需要二价阳离不同，不需要二价阳离子的存在，子的存在，EDTA等金属离子整合剂对其活性无等金属离子整合剂对其活性无任何影响。任何影响。 3、防止、防止RNase对对RNA的水解原则：的

20、水解原则： 一要避免细胞外一要避免细胞外RNase的污染并抑制的污染并抑制其活性，其活性， 二要尽快地抑制细胞内二要尽快地抑制细胞内RNase的活性的活性并极力地去除并极力地去除RNase。 二、总二、总RNA的分离与纯化：的分离与纯化： (一一)(异异)硫氰酸胍硫氰酸胍-酚氯仿一步法酚氯仿一步法(二二)同时制备同时制备RNA、DNA与蛋白质的一步与蛋白质的一步法法 本方法是本方法是(异异)硫氰酸胍硫氰酸胍-酚氯仿一步酚氯仿一步法的改进方法。法的改进方法。(三三)其它方法其它方法 三、三、mRNA的分离与纯化的分离与纯化 (一一) oligo (dT)-纤维素柱层析法纤维素柱层析法 (二二)oligo (dT)-纤维