植物总RNA的提取及RT-PCR

1、植物总RNA的提取及RT-PCR一、实验目的1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法二、实验原理1. RNA提取的原理RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质,破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。2. RT-PCR的原理提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(

2、dT)作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。三、仪器、药品与试剂配方(一) 仪器及器皿1低温离心机；2琼脂糖凝胶电泳系统；3高压灭菌锅；4.PCR仪；5研钵；6.一次性手套等；7.离心管；8.培养皿；9.烧杯及试剂瓶等(二) 药品1.焦碳酸二乙酯(DEPC)4.苯酚7.乙醇10.MLV反转录试剂盒2.异硫氰酸胍(GT)5.异丙醇8.0巯基乙醇11.TaqDNA聚合酶3.醋酸钠(Na

3、Ac)6.氯仿9.琼脂糖12.引物(三)试剂配制1. 0.1%DEPC水灭菌2. 4mol/L异硫氰酸胍3. 2mol/LNaAc(pH4.8)灭菌4. 3mol/LNaAc(pH4.8)灭菌5. 4mol/LLiCl灭菌6. 1XTE缓冲液：10mMTris-HCl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0),灭菌。四、实验步骤(一)总RNA的提取(1) 研钵冷却后，倒入2/3液氮，加入0.2g植物材料，充分研磨后转入一个含有300卩1的4MGT的1.5ml的聚丙烯管中，摇匀。(2) 加入30口2MNaAc(pH4.9-5.2)摇匀，加入300卩1酸酚(水饱和酚pH5.0),摇匀，加入100

4、卩1三氯甲烷，摇匀。(3) 12000rpm4°C离心20min,吸取上清，加入等体积异丙醇，于冰上放置15min。(4) 12000rpm4C离心10min，将沉淀悬浮于含100pl4M氯化锂的1.5mlEP管中，于-20C放置1小时或更长时间。(5) 12000rpm4C离心10-15min，将沉淀溶于0.4mlDEPC水中，加入1/2体积氯仿和1/2体积酸酚，摇匀，进行抽提，12000rpm4C离心5min；上清加入等体积氯仿，摇匀，进行抽提，12000rpm4C离心5min。(6) 上清液加入1/10体积的3M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇于-20C放置1小时或更长时间。(7)

5、12000rpm4C离心15min，超净台吹干，沉淀溶于10plb灭菌的DEPC水中。(8) RNA贮于-80C。(二)RNA反转录产生CDNA在DEPC处理过的离心管中冰上按下表加入：模板RNA2AlOlig(dT)18181AlDEPC水2Al混匀，70C水浴中放置2min，立即放置到冰上2min。然后在冰上依次加入RNasin0.5AlMMLV1Al5Xbuffer2Al10mMdNTP1.5Al42C，水浴中反应90min。72C，10min，终止反应。加入15M的DEPC灭菌水，使总体积达到25M。(三)PCR1. 在灭菌的PCR管中加入以下成分，形成PCR反应体系10Xbuffer

6、2.5MdNTP(2.5mmol)2MRT-PCR产物5MTaq酶0.5M上游引物(10Amol/l)0.5M下游引物(10Amol/l)0.5Al灭菌ddHO加到25Al2. 按照下列条件进行PCR反应94C5min94C30s55C30s72C1min30个循环72C7min4C(四)电泳检测将加EB的1%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1XTE电泳缓冲液，覆盖凝胶约1mm。将RNA及DNA样品加到凝胶点样孔中，85V条件下电泳30min,在紫外灯下观察结果。五、注意事项1在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。2. RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。3. 使用DEPC时，应在通风橱中戴手套操作。4. RNA提取用品准备：1）普通的玻璃器皿：180°C烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。3）电泳槽：去污剂洗干净，水冲洗，3%