细胞生物学研究方法学习教案

1、会计学1细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)方法方法第一页，共42页。第2页/共42页第二页，共42页。(二)荧光(ynggung)显微镜:荧光：特定物质可以在紫外线激发后，发射(fsh)出更长波长的可见光，即荧光。暗背景(bijng)，强反差，彩色图像（荧光染料）荧光分子：在激发后可发射荧光的物质即荧光分子 。 （由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此可做荧光染料用,荧光分子也可以称作荧光染料。）第3页/共42页第三页，共42页。荧光显微镜的应用定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质。对活细胞(xbo)内分子的动态变化进行实时观察。 第4页/共42页第四页，共42页。 活细胞

2、的微细(wix)结构和变化、分裂和运动等。第5页/共42页第五页，共42页。相差显微镜观察(gunch)培养中的HeLa细胞第6页/共42页第六页，共42页。第7页/共42页第七页，共42页。(四)暗视野显微镜通过(tnggu)散射光成像应用：分辨率不高。用于观察(gunch)未经染色、无色透明的物体的轮廓和运动以及活细胞的质膜、纤毛、细胞核等结构。原理：散射光成像。聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本散射的光线进入物镜，因而视野的背景(bijng)是黑的，物体的边缘是亮的。第8页/共42页第八页，共42页。(五)显微电影摄影技术(jsh)记录细胞或细胞器的运动过程 原理：

3、用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔拍摄。应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度。 第9页/共42页第九页，共42页。特点(tdin)：p高清晰p可形成(xngchng)被检物体的三维图像结构：第10页/共42页第十页，共42页。普通荧光显微镜（a）与激光共聚焦(jjio)显微镜（b）的成像比较第11页/共42页第十一页，共42页。第12页/共42页第十二页，共42页。第13页/共42页第十三页，共42页。(一)透射(tu sh)电子显微镜（transmission electron microscope，TEM ）光学显微镜与透射(tu sh)电子显微镜的比较原理：通过电子束穿透(c

4、hun tu)标本后成像。 应用：用来观察细胞的超微结构。第14页/共42页第十四页，共42页。透射电镜及其图像(t xin)第15页/共42页第十五页，共42页。第16页/共42页第十六页，共42页。扫描电镜及其图像(t xin)第17页/共42页第十七页，共42页。第18页/共42页第十八页，共42页。第19页/共42页第十九页，共42页。第20页/共42页第二十页，共42页。第21页/共42页第二十一页，共42页。第22页/共42页第二十二页，共42页。电镜与光镜区别主要在于： （1）光源不同 光镜为可见光或紫外线,电镜为电子束 （2）透镜不同 光镜为玻璃(b l)；电镜为电磁透镜 （3

5、）电镜要求真空 （4）电镜分辨力高(具体） (5) 成像原理不同（具体）第23页/共42页第二十三页，共42页。第二节 细胞的分离(fnl)与培养细胞(xbo)分离的第一步是要将细胞(xbo)从组织中分离出来，制备出单细胞(xbo)悬液。细胞分离操作(cozu)的原则： 等渗 低温 无菌操作(cozu) 根据不同细胞的特征采用不同的细胞分离方法。第24页/共42页第二十四页，共42页。 细胞分离方法离心方法 流式细胞术 免疫磁珠法 激光捕获显微切割技术 第25页/共42页第二十五页，共42页。(一)离心方法(fngf) 利用细胞的密度特性可有效分离不同的细胞。如血浆白细胞和红细胞的分离。 第2

6、6页/共42页第二十六页，共42页。第27页/共42页第二十七页，共42页。第28页/共42页第二十八页，共42页。第29页/共42页第二十九页，共42页。 二、细胞培养细胞培养(cell culture)：从机体中取出组织或细胞，模拟体内的生理环境，使之能够(nnggu)继续生存、生长和增殖的一种方法。1.条件(tiojin) 营养条件(tiojin)：培养基：RPMI-1640、DMEM。 血清。 5%CO2 无菌环境第30页/共42页第三十页，共42页。第31页/共42页第三十一页，共42页。2.细胞(xbo)培养的主要方式是原代培养和传代培养原代培养（primary culture）：

7、直接从体内获取的组织和细胞(xbo)进行的首次培养。传代培养（secondary culture）：原代培养的细胞经过增殖达到一定密度后，将细胞(xbo)分散，从一个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养。第32页/共42页第三十二页，共42页。3.来源于体内的细胞可在体外建系（细胞系）细胞系（cell line）：在培养的细胞中产生“不死”的 变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。细胞系的来源取材于肿瘤组织的原代培养细胞（Hela细胞系）培养过程中发生转化(zhunhu)的正常细胞细胞株（cell strain）：用细胞克隆(k ln)化的方法进一步改 善细胞系的均一性，即分离出单

8、个细胞使之增殖 形成的细胞群。第33页/共42页第三十三页，共42页。第34页/共42页第三十四页，共42页。单克隆抗体技术正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以(ky)在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。第35页/共42页第三十五页，共42页。第36页/共42页第三十六页，共42页。一、细胞(xbo)裂解在细胞组分分离前，首先破碎(p su)细胞，制备细胞裂解液方法： 低渗透压； 超声振荡； 强制通过微孔； 机械破碎(p su)及研磨； 反复冻融 第37页/共42页第三十七页，共42页。二、细胞器及细胞组分(zfn)的分级离心 (一)差速离心（differential centrifugation）方法：从低速到高速(o s)逐级沉降。分离对象：体积、质量差别较大的颗粒 。第38页/共42页第三十八页，共42页。匀浆离心1 000g 20分钟细胞核线粒体等离心15 000g 120分钟微粒体离心0.26