高效液相色谱柱

1、高效液相色谱柱高效液相色谱柱姓名：姓名：专业：专业：2022-5-41材料与化学化工学院目录CONTENT色谱柱填料色谱柱填料与固定相与固定相第二章第二章色谱柱的结色谱柱的结构与特征构与特征第一章第一章色谱柱的装色谱柱的装填、性能指填、性能指标标第三章第三章第四章第四章色谱柱常见色谱柱常见问题分析问题分析2022-5-42材料与化学化工学院1 色谱柱的结构与特征2022-5-43材料与化学化工学院一一 色谱柱的结构与特征色谱柱的结构与特征2022-5-441.4液相色谱锥形柱与锥尾柱液相色谱锥形柱与锥尾柱1.1色谱柱的类型色谱柱的类型1.2一般色谱柱的结构一般色谱柱的结构1.3一般制备柱的结构

2、一般制备柱的结构1.5径向色谱柱径向色谱柱材料与化学化工学院1.1 1.1 色谱柱的类型色谱柱的类型2022-5-45 按照分离规模及色谱按照分离规模及色谱柱的几何参数可以分为：柱的几何参数可以分为：制备柱、分析柱、微型制备柱、分析柱、微型柱等。柱等。 按照色谱柱中流动相按照色谱柱中流动相的流向不同可分为：纵的流向不同可分为：纵向柱、径向柱、锥形柱向柱、径向柱、锥形柱等，通常在无特殊说明等，通常在无特殊说明的情况下所说的色谱柱的情况下所说的色谱柱皆指纵向柱，径向柱和皆指纵向柱，径向柱和锥形柱一般在制备色谱锥形柱一般在制备色谱中应用。中应用。柱型柱型柱内径柱内径（mmmm）流动相流速流动相流速样

3、品容量样品容量制备柱制备柱101.6101.6960ml/min960ml/min2.5g2.5g制备柱制备柱50.850.8240ml/min240ml/min600mg600mg制备柱制备柱25.425.461ml/min61ml/min150mg150mg半制备柱半制备柱9 911ml/min11ml/min25mg25mg常规柱常规柱4.64.60.50.52.0ml/min2.0ml/min0.20.27mg7mg细内径柱细内径柱2.12.10.20.20.4ml/min0.4ml/min0.050.050.2mg0.2mg微柱微柱0.80.81.01.025256060l/minl

4、/min5050500500g g毛细管柱毛细管柱0.10.10.50.51 11515l/minl/min1 15050g g纳米柱纳米柱0.50.51 1l/minl/min1 1g g材料与化学化工学院1.2 1.2 一般色谱柱的结构一般色谱柱的结构2022-5-46 HPLC HPLC色谱柱大多是用内壁经高度抛光处理的色谱柱大多是用内壁经高度抛光处理的直不锈钢管直不锈钢管，不锈钢可用于，不锈钢可用于所有有机溶剂与大多数水性缓冲液。但是含氯的流动相会缓慢的腐蚀不锈钢材所有有机溶剂与大多数水性缓冲液。但是含氯的流动相会缓慢的腐蚀不锈钢材质（尤其在低质（尤其在低PHPH值时）所以使用该类型流

5、动相时应小心。值时）所以使用该类型流动相时应小心。也有用玻璃、玻璃衬也有用玻璃、玻璃衬里不锈钢与塑料里不锈钢与塑料制作的商品柱，用于可能与不锈钢发生反应的特殊样品。制作的商品柱，用于可能与不锈钢发生反应的特殊样品。 筛板是色谱柱中非常重要的部分，它的主要作用是封闭色谱柱的两头，筛板是色谱柱中非常重要的部分，它的主要作用是封闭色谱柱的两头，防止填料微粒流失，一般是用具有特定粒度的不锈钢或者镍粉末在模型中烧结防止填料微粒流失，一般是用具有特定粒度的不锈钢或者镍粉末在模型中烧结而成，颗粒间隙即为筛板的孔，筛孔应小于填料的直径，一般而成，颗粒间隙即为筛板的孔，筛孔应小于填料的直径，一般5 5 m m和

6、和3 3 m m的的微粒分别用微粒分别用2 2 m m和和0.450.45 m m孔径的筛板。孔径的筛板。材料与化学化工学院1.3 1.3 一般制备柱的结构一般制备柱的结构2022-5-47 这种色谱柱可用于大规模复杂样品的分离和制备，由于制备型色谱柱体积这种色谱柱可用于大规模复杂样品的分离和制备，由于制备型色谱柱体积和重量都较大，使用过程中必须小心。和重量都较大，使用过程中必须小心。这种色谱柱的两端结构完全一致，故用这种色谱柱的两端结构完全一致，故用户可以自行确定色谱柱的入口和出口户可以自行确定色谱柱的入口和出口；一旦确定入口和出口后，使用过程中非；一旦确定入口和出口后，使用过程中非特殊原因

7、不要颠倒，否则易造成两端填料同时污染，不利于维护。特殊原因不要颠倒，否则易造成两端填料同时污染，不利于维护。材料与化学化工学院1.4 1.4 液相色谱锥形柱与锥尾柱液相色谱锥形柱与锥尾柱2022-5-48锥形柱：锥形柱：与传统的圆柱形柱不同，锥形柱是内径渐变的，导致流动相的线与传统的圆柱形柱不同，锥形柱是内径渐变的，导致流动相的线速度在柱内加速运动。内径渐变小的加速度为正，反之则反。制备级色谱的进速度在柱内加速运动。内径渐变小的加速度为正，反之则反。制备级色谱的进样量一般是过载运行，导致分离效率下降，产品的纯度受到损失样量一般是过载运行，导致分离效率下降，产品的纯度受到损失. .样品的质量样品

8、的质量过载通常在色谱柱的人口处发生，在样品沿色谱柱向下流动过程中，由于流动过载通常在色谱柱的人口处发生，在样品沿色谱柱向下流动过程中，由于流动相在色谱柱中对样品的稀释效应，相在色谱柱中对样品的稀释效应， 质量过载情况会逐步减弱质量过载情况会逐步减弱. .大入口锥型柱由大入口锥型柱由于柱子入口处截面积较大，在柱容积相同的条件下，对样品的负载能力大于圆于柱子入口处截面积较大，在柱容积相同的条件下，对样品的负载能力大于圆柱型柱，在相同的进样量时，柱效损失较小。柱型柱，在相同的进样量时，柱效损失较小。锥尾柱：锥尾柱：在制备液相色谱中，色谱柱内径较大，而连接管线的内径较小，在制备液相色谱中，色谱柱内径较

9、大，而连接管线的内径较小，从大直径直接过渡到小直径，流体易产生涡流分散和局部滞留，柱效降低从大直径直接过渡到小直径，流体易产生涡流分散和局部滞留，柱效降低. .锥锥型柱尾内径逐渐减小，避免了上述问题，很多的制备色谱柱都采用锥型柱尾内径逐渐减小，避免了上述问题，很多的制备色谱柱都采用锥 型柱尾型柱尾. .材料与化学化工学院1.5 1.5 径向色谱柱径向色谱柱2022-5-49径向色谱柱采用径向流动技径向色谱柱采用径向流动技术，样品和流动相沿径向流动术，样品和流动相沿径向流动（而不是如传统色谱柱即轴向色（而不是如传统色谱柱即轴向色谱柱，样品和流动相是从柱的一谱柱，样品和流动相是从柱的一端流向另一端

10、），端流向另一端），可以从柱的周可以从柱的周围流向柱圆心，也可以从柱圆心围流向柱圆心，也可以从柱圆心流向柱的周围流向柱的周围。一般结构的径向。一般结构的径向柱中，通常采用从柱的周围流向柱中，通常采用从柱的周围流向柱圆心的方式。柱圆心的方式。材料与化学化工学院2 2 色谱柱填料色谱柱填料与固定相与固定相2022-5-410材料与化学化工学院二二 色谱柱填料与固定相色谱柱填料与固定相2022-5-411u 2.1 2.1 柱填料特性柱填料特性u 2.2 2.2 硅胶微粒硅胶微粒u 2.3 2.3 多孔聚合物多孔聚合物u 2.4 2.4 键合硅胶键合硅胶u 2.5 2.5 新型新型HPLCHPLC固

11、定相固定相2.5.1 2.5.1 高稳定性化学键合硅胶固定相高稳定性化学键合硅胶固定相2.5.2 2.5.2 有机有机- -无机杂化基质固定相无机杂化基质固定相材料与化学化工学院2.1 2.1 柱填料特性柱填料特性2022-5-412固定相基质固定相基质无机基质无机基质有机基质有机基质氧化硅、氧化氧化硅、氧化铝、氧化锆等铝、氧化锆等无机氧化物无机氧化物聚羟基甲基丙烯酸丙聚羟基甲基丙烯酸丙酯、聚乙烯醇等亲水酯、聚乙烯醇等亲水性聚合物；葡萄糖、性聚合物；葡萄糖、纤维素等软胶纤维素等软胶优点：机械强度高、溶胀优点：机械强度高、溶胀性小、耐高压、可通过表性小、耐高压、可通过表面改性引入多种功能基满面改

12、性引入多种功能基满足足HPLCHPLC分离需要。缺点：分离需要。缺点：表面性质复杂，容易导致表面性质复杂，容易导致溶质分子非特征性吸附溶质分子非特征性吸附优点：化学稳定性好，优点：化学稳定性好，同时表面化学性能比较同时表面化学性能比较均一，缺点：但其他方均一，缺点：但其他方面较无机基质较差。面较无机基质较差。材料与化学化工学院2022-5-4132.1 2.1 柱填料特性柱填料特性目前目前HPLCHPLC分析中常用的几种填料类型主要包括：全多孔微球、薄壳型微分析中常用的几种填料类型主要包括：全多孔微球、薄壳型微球、灌注色谱填料等。其中由于球、灌注色谱填料等。其中由于全多孔微球填料全多孔微球填料

13、很好的兼顾柱效、样品容量、很好的兼顾柱效、样品容量、使用寿命、灵活性等众多理想的性质，因此应用最为普遍。薄壳型微球仅适使用寿命、灵活性等众多理想的性质，因此应用最为普遍。薄壳型微球仅适于分析性于分析性HPLCHPLC。灌注色谱填料非常适于蛋白质等大分子的制备分离，但用于。灌注色谱填料非常适于蛋白质等大分子的制备分离，但用于小分子分析分离较少。小分子分析分离较少。综合考虑柱效、反压和寿命等方面因素，目前约综合考虑柱效、反压和寿命等方面因素，目前约5 5m m粒径固定相在分析粒径固定相在分析型型HPLCHPLC中应用最为广泛，中应用最为广泛，1.51.5 3 3m m左右的多孔或无孔微粒在快速分离

14、中左右的多孔或无孔微粒在快速分离中显示出较为明显的优势。粒度分布范围越窄，填充色谱柱床的稳定性越好、显示出较为明显的优势。粒度分布范围越窄，填充色谱柱床的稳定性越好、柱效越高，同时压力降最小，一般要求粒度分布范围不超过平均值的柱效越高，同时压力降最小，一般要求粒度分布范围不超过平均值的 50 50。材料与化学化工学院2.2 2.2 硅胶微粒硅胶微粒2022-5-414硅胶及键合硅胶是开发最早、研究深入、应用广泛的硅胶及键合硅胶是开发最早、研究深入、应用广泛的HPLCHPLC固定相，这主固定相，这主要是基于硅胶基质良好的物理特性与完善的制备工艺。要是基于硅胶基质良好的物理特性与完善的制备工艺。大

15、多数硅胶微粒的机械强度很高，可保证填充床长时间在很高的操作压大多数硅胶微粒的机械强度很高，可保证填充床长时间在很高的操作压力下工作，柱效保持稳定。同时，由于硅胶表面存在活性硅羟基，能够通过力下工作，柱效保持稳定。同时，由于硅胶表面存在活性硅羟基，能够通过表面化学修饰引入种类繁多的、具有不同官能团的键合相。表面化学修饰引入种类繁多的、具有不同官能团的键合相。未修饰硅胶表面化学性质随制备和处理条件不同而变化。水合硅胶表面未修饰硅胶表面化学性质随制备和处理条件不同而变化。水合硅胶表面存在三种硅羟基存在三种硅羟基。完全羟基化的硅胶完全羟基化的硅胶基质固定相氢化硅基质固定相氢化硅羟基浓度高，酸性比羟基浓

16、度高，酸性比游离硅羟基弱，有利于游离硅羟基弱，有利于碱性化合物的色谱分离。碱性化合物的色谱分离。氢化硅氢化硅羟基羟基硅羟硅羟基基表层表层热处理温度高于热处理温度高于800 800 时大部分不存在，时大部分不存在，已无使用价值。已无使用价值。游离硅羟基酸性很强，因游离硅羟基酸性很强，因此该类硅胶固定相往往使此该类硅胶固定相往往使碱性化合物保留值增加碱性化合物保留值增加峰变宽、拖尾。峰变宽、拖尾。游离硅游离硅羟基羟基硅胶基质的纯度对分离也极为重要，硅胶中的硅胶基质的纯度对分离也极为重要，硅胶中的FeFe、AlAl、ZnZn等金属杂质易络合导致拖等金属杂质易络合导致拖尾甚至化合物完全被固定相吸附，不

17、能洗脱。因此，许多尾甚至化合物完全被固定相吸附，不能洗脱。因此，许多HPLCHPLC分离需用高纯硅胶。分离需用高纯硅胶。材料与化学化工学院2.3 2.3 多孔聚合物多孔聚合物优点缺点化学稳定性好，使化学稳定性好，使用用PHPH值范围宽；表值范围宽；表面性质均匀，溶质面性质均匀，溶质和固定相之间较少和固定相之间较少发生非特征性吸附；发生非特征性吸附；蛋白质等生物活性蛋白质等生物活性物质的回收率高；物质的回收率高；具较好的重复性和具较好的重复性和独特的选择性。独特的选择性。与相同粒度的硅与相同粒度的硅胶基质色谱柱比胶基质色谱柱比较，多孔聚合物较，多孔聚合物柱的主要缺点就柱的主要缺点就是是柱效低，分

18、离柱效低，分离慢慢。其次，这种。其次，这种载体在不同有机载体在不同有机改性剂中溶胀程改性剂中溶胀程度不同，因此填度不同，因此填充床会因微粒溶充床会因微粒溶胀不同而变化，胀不同而变化，在梯度洗脱中溶在梯度洗脱中溶胀现象的影响更胀现象的影响更为明显。为明显。2022-5-415材料与化学化工学院2.4 2.4 键合硅胶键合硅胶键合硅胶固定相一般是通过键合硅胶固定相一般是通过-Si-O-Si-Si-O-Si-共价键合有机硅烷或凃覆聚合物层得到，根共价键合有机硅烷或凃覆聚合物层得到，根据官能团的差异可以得到多种不同性质的固定相，以满足各种样品的分离分析。据官能团的差异可以得到多种不同性质的固定相，以满

19、足各种样品的分离分析。类别类别固定相固定相特点特点反相反相C18(C18(十八烷基或十八烷基或ODSODS) )稳定性好，保留能力强，用途广稳定性好，保留能力强，用途广C8C8（辛基）辛基）与与C18C18相似，但保留能力减低相似，但保留能力减低C3C3，C4C4保留能力弱；多用于肽类与蛋白质分离保留能力弱；多用于肽类与蛋白质分离CN(CN(氰基氰基) )保留值适中，选择性有所不同保留值适中，选择性有所不同NH2(NH2(氨基氨基) )保留弱，用于烃类，稳定性不够理想保留弱，用于烃类，稳定性不够理想正相正相CN(CN(氰基氰基) )稳定性好，极性适中，用途广稳定性好，极性适中，用途广OH(OH

20、(二醇基二醇基) )极性大于极性大于CNCNNH2(NH2(氨基氨基) )极性强，稳定性不够理想极性强，稳定性不够理想硅胶硅胶耐用性好，价廉，操作不够方便耐用性好，价廉，操作不够方便尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱硅烷化硅胶硅烷化硅胶吸附性弱，溶剂兼容性好吸附性弱，溶剂兼容性好OH(OH(二醇基二醇基) )不够稳定，在凝胶过滤色谱中应用多不够稳定，在凝胶过滤色谱中应用多聚苯乙烯基聚苯乙烯基广泛用于凝胶渗透色谱广泛用于凝胶渗透色谱离子交换色谱离子交换色谱键合相键合相稳定性与重现性均不理想稳定性与重现性均不理想聚苯乙烯基聚苯乙烯基柱效不高，稳定，重现性好柱效不高，稳定，重现性好HPLCHPLC中常用的固定

21、相中常用的固定相2022-5-416材料与化学化工学院2.5 2.5 新型新型HPLCHPLC固定相固定相（3 3）制备硅胶的原料、制备方法与处理条件、键合反应试）制备硅胶的原料、制备方法与处理条件、键合反应试剂种类、原料等对所得固定相的色谱柱性能有很大影响，剂种类、原料等对所得固定相的色谱柱性能有很大影响，不同品牌固定相性能差异有时非常显著。不同品牌固定相性能差异有时非常显著。（1 1）碱性化合物在固定相上拖尾严重，甚至产生不可逆吸）碱性化合物在固定相上拖尾严重，甚至产生不可逆吸附。附。（2 2）在）在PHPH值大于值大于8 8的流动相下，的流动相下，SiO2SiO2会溶解，而在会溶解，而在

22、PHPH小于小于2 2时，键合相会逐渐水解，因此时，键合相会逐渐水解，因此SiO2SiO2固定相能稳定使用的固定相能稳定使用的PHPH值范围较窄，不能满足分离要求。值范围较窄，不能满足分离要求。虽然虽然SiO2SiO2基质固定相在基质固定相在HPLCHPLC领域已得到了广泛应用，但尚存如下缺陷：领域已得到了广泛应用，但尚存如下缺陷：2022-5-417材料与化学化工学院2.5 2.5 新型新型HPLCHPLC固定相固定相采用金属杂采用金属杂质含量极低质含量极低的硅胶作为的硅胶作为制备键合固制备键合固定相的基质。定相的基质。改进表面改改进表面改性方法，如性方法，如提高键合烷提高键合烷基链长度，基

23、链长度，聚合物或碳聚合物或碳凃覆硅胶表凃覆硅胶表面。面。改变键合基改变键合基团的性质，团的性质，如在烷基键如在烷基键合相中引入合相中引入极性极性 掩蔽残掩蔽残留硅羟基。留硅羟基。选择其他选择其他Al2O3Al2O3、碳、碳、聚合物等代聚合物等代替替SiO2SiO2作为作为固定相基质。固定相基质。针对上述问题，目前采用的主要改进方法：针对上述问题，目前采用的主要改进方法：2022-5-418材料与化学化工学院2.5.1 2.5.1 高稳定性化学键合硅胶固定相高稳定性化学键合硅胶固定相通常键合通常键合SiOSiO2 2固定相包括功能基（固定相包括功能基（C18C18、C8C8、C4C4、CNCN等

24、）和两个甲基，在含等）和两个甲基，在含水流动相，尤其是酸性条件下，水流动相，尤其是酸性条件下，C1C1、C4C4、CNCN、苯基等键合、苯基等键合SiOSiO2 2固定相较易水解。固定相较易水解。为了掩蔽为了掩蔽SiOSiO2 2表面活性吸附中心、提高固定相适用表面活性吸附中心、提高固定相适用PHPH值范围，采用聚合物、值范围，采用聚合物、碳等涂覆改性碳等涂覆改性SiOSiO2 2取得了进展。取得了进展。目前较多采用聚苯乙烯、聚苯乙烯目前较多采用聚苯乙烯、聚苯乙烯- -二乙烯基苯等聚合物涂覆或通过多功二乙烯基苯等聚合物涂覆或通过多功能基硅烷、聚硅氧烷等键合能基硅烷、聚硅氧烷等键合SiOSiO2

25、 2作为反相色谱固定相，涂覆乙烯亚胺、聚丁二作为反相色谱固定相，涂覆乙烯亚胺、聚丁二烯烯- -顺丁烯二醛共聚物等作为离子交换色谱固定相。顺丁烯二醛共聚物等作为离子交换色谱固定相。2022-5-419材料与化学化工学院2.5.2 2.5.2 有机有机- -无机杂化基质固定相无机杂化基质固定相沃特世公司采用甲基三乙氧基硅烷和四乙氧基硅烷混合前体，制备沃特世公司采用甲基三乙氧基硅烷和四乙氧基硅烷混合前体，制备含无机硅与有机硅氧烷单元的干纯杂化微球，其中有机硅烷单元分布于含无机硅与有机硅氧烷单元的干纯杂化微球，其中有机硅烷单元分布于颗粒内部及表面位置，甲基约取代了三分之一的表面硅羟基，相对纯硅颗粒内部

26、及表面位置，甲基约取代了三分之一的表面硅羟基，相对纯硅胶基质，这种杂化基质表面的硅羟基的分布更加分散有序，通过键合反胶基质，这种杂化基质表面的硅羟基的分布更加分散有序，通过键合反应引入烷基链的空间位阻作用相对减少，所以键合反应得到的固定相在应引入烷基链的空间位阻作用相对减少，所以键合反应得到的固定相在表面均匀性和残留硅羟基两方面均有明显改善表面均匀性和残留硅羟基两方面均有明显改善。2022-5-420材料与化学化工学院3 色谱柱的装填、性能指标2022-5-421材料与化学化工学院三三 色谱柱的装填、性能指标色谱柱的装填、性能指标色谱柱的装填、性能指色谱柱的装填、性能指标标3.13.1色谱柱性

27、能指标色谱柱性能指标3.23.2保留值的重现性保留值的重现性3.33.3压力降压力降3.43.4色谱柱寿命色谱柱寿命2022-5-422材料与化学化工学院3.1 3.1 色谱柱性能指标色谱柱性能指标2022-5-423 实验选择色谱柱的类型和构型（粒度、长度、内径等）通常由实验选择色谱柱的类型和构型（粒度、长度、内径等）通常由分离目的决定，对于特定类型的色谱柱，不同品牌之间可能存在很大的分离目的决定，对于特定类型的色谱柱，不同品牌之间可能存在很大的差异，只有了解色谱柱的基本指标与方法才有可能进行比较。差异，只有了解色谱柱的基本指标与方法才有可能进行比较。通常色谱通常色谱柱要求的主要指标包括：柱

28、要求的主要指标包括： 某指定某指定K K值得理论塔板数值得理论塔板数N N 峰不对称因子峰不对称因子ASAS 两种不同溶质的选择性两种不同溶质的选择性a a 色谱柱反压色谱柱反压 保留值的重现性保留值的重现性 色谱柱的稳定性色谱柱的稳定性材料与化学化工学院3.1.1 3.1.1 理论塔板数理论塔板数2022-5-424塔板数是色谱柱的一个重要特性，一支色谱柱的理论塔板数越高，色谱峰塔板数是色谱柱的一个重要特性，一支色谱柱的理论塔板数越高，色谱峰越尖锐，表明色谱柱对溶质的分离能力强，即柱效高。越尖锐，表明色谱柱对溶质的分离能力强，即柱效高。理论塔板数的定义：理论塔板数的定义：N=16N=16（t

29、 tR R/w/w）2 2为了避免测定基线宽度为了避免测定基线宽度W W带来误差，带来误差，N N值较为实用公式：值较为实用公式：N=5.54N=5.54（t tR R/w/w1/21/2）2 2t tR R: : 谱峰的保留时间谱峰的保留时间w w1/21/2：半高处的峰宽：半高处的峰宽提高色谱柱理论塔板数的因素包括：色谱柱填充良好；增加色谱柱长度；提高色谱柱理论塔板数的因素包括：色谱柱填充良好；增加色谱柱长度；适当降低流速；采用小粒度填料；采用低粘度流动相；升高色谱柱温度。适当降低流速；采用小粒度填料；采用低粘度流动相；升高色谱柱温度。材料与化学化工学院3.1.1 3.1.1 理论塔板数理

30、论塔板数微粒直径微粒直径/ /m m柱长柱长/ /cmcm塔板数塔板数 N N101015156000600070007000101025258000800010000100005 5101070007000900090005 51515100001000012000120005 52525170001700020000200003 35 560006000700070003 37.57.59000900011000110003 31010120001200014000140003 3151517000170002000020000 下图表明填充良好的各种长度与粒度的液相色谱柱在最佳条下图表明

31、填充良好的各种长度与粒度的液相色谱柱在最佳条件下的塔板数（小分子中性样品件下的塔板数（小分子中性样品Mr200Mr200）式子：式子：N 3500L/dN 3500L/dp p能用于估计在这些优化条件下，小分子的柱塔板数。式中，能用于估计在这些优化条件下，小分子的柱塔板数。式中，L L为为柱长；柱长；d dp p为微粒直径为微粒直径2022-5-425材料与化学化工学院2022-5-4263.1.23.1.2不对称与拖尾峰不对称与拖尾峰不对称因子（不对称因子（t t），用以衡量色谱峰的对称性。用以衡量色谱峰的对称性。t=B/A,t=B/A,在整个峰高的在整个峰高的10%10%处测定处测定，中国

32、药典中国药典规定规定t t应为应为0.950.951.051.05。t t0.950.95为前延峰，为前延峰，t t1.051.05为为拖尾峰，拖尾峰，t=1.0t=1.0时为绝对对称峰。时为绝对对称峰。峰拖尾因子（峰拖尾因子（T T）T=A+B/2AT=A+B/2A，在整个峰高的，在整个峰高的5%5%处测定处测定，不对称因子和拖尾，不对称因子和拖尾因子的换算如下：因子的换算如下：不对称因子（不对称因子（10%10%峰高）峰高） 拖尾因子（拖尾因子（5%5%峰高）峰高）不对称因子（不对称因子（10%10%峰高）峰高） 拖尾因子（拖尾因子（5%5%峰高）峰高）1.0 1.0 1.0 1.0 1.

33、91.91.61.61.31.31.21.22.22.21.81.81.61.61.41.42.52.52.0 2.0 材料与化学化工学院2022-5-4273.23.2保留值的重现性保留值的重现性不同品牌色谱柱之间的保留时间或容量因子不同品牌色谱柱之间的保留时间或容量因子K K值得重现性，可通过测定值得重现性，可通过测定一系列的标准品来比较，最好采用极性和非极性化合物的混合样品。一般色一系列的标准品来比较，最好采用极性和非极性化合物的混合样品。一般色谱柱厂家提供试验测定方法评价原色谱柱的性能，用户实验室可定期重复该谱柱厂家提供试验测定方法评价原色谱柱的性能，用户实验室可定期重复该实验，以确定

34、色谱柱性能状态。实验，以确定色谱柱性能状态。材料与化学化工学院2022-5-4283.3 3.3 压力降压力降一般情况下，色谱柱的压力降与使用的操作条件、色谱柱尺寸和微粒粒一般情况下，色谱柱的压力降与使用的操作条件、色谱柱尺寸和微粒粒度有关，随色谱柱增长和填充微粒粒径减小反压升高，不同品牌的相同粒度度有关，随色谱柱增长和填充微粒粒径减小反压升高，不同品牌的相同粒度的填料的反压可能存在很大的差异，主要由于其中粒度分布范围存在差异。的填料的反压可能存在很大的差异，主要由于其中粒度分布范围存在差异。用球状微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估算：用球状微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估算：P=3000L

35、P=3000L /t/t0 0d dp p2 2P:P:压力压力L L：柱长：柱长 ：流动相粘度：流动相粘度T T0 0: :色谱柱的死时间色谱柱的死时间D Dp p：微粒的直径：微粒的直径材料与化学化工学院2022-5-4293.4 3.4 色谱柱寿命色谱柱寿命装填良好的色谱柱的稳定性与使用寿命，取决于操作者对色谱装填良好的色谱柱的稳定性与使用寿命，取决于操作者对色谱柱的使用和维护条件，当色谱柱不再能保证特殊样品所需的性能时，柱的使用和维护条件，当色谱柱不再能保证特殊样品所需的性能时，则应更换新柱。则应更换新柱。如果塔板数下降如果塔板数下降50%50%，或分离度降至原值的，或分离度降至原值的

36、3/43/4，可，可能需要更换新柱能需要更换新柱。色谱柱使用多长时间应更换，与注入样品的类型关系很大。一色谱柱使用多长时间应更换，与注入样品的类型关系很大。一般干净样品，即均匀溶液，每支色谱柱正常分析次数般干净样品，即均匀溶液，每支色谱柱正常分析次数1000-20001000-2000次。次。复杂和脏样品或临界分析条件的样品，每支柱正常分析次数复杂和脏样品或临界分析条件的样品，每支柱正常分析次数200-500200-500次。来自生物或者极为复杂物质，每支分析次数次。来自生物或者极为复杂物质，每支分析次数50-20050-200次。在特殊次。在特殊情况下，没有预处理的样品一次进样就可能导致柱头

37、筛板堵塞或者情况下，没有预处理的样品一次进样就可能导致柱头筛板堵塞或者填料变性，色谱柱失效。为延长寿命，可使用保护住或者加装过滤填料变性，色谱柱失效。为延长寿命，可使用保护住或者加装过滤器滤去颗粒，这些装置必须定期更换。器滤去颗粒，这些装置必须定期更换。材料与化学化工学院4 色谱柱常见问题分析2022-5-430材料与化学化工学院四四 色谱柱常见问题分析色谱柱常见问题分析4.14.14.34.34.24.2 色谱柱寿命色谱柱寿命保留值与分离保留值与分离度重现性不好度重现性不好色谱峰拖尾色谱峰拖尾2022-5-431材料与化学化工学院4.1 4.1 色谱柱寿命色谱柱寿命322022-5-4色谱柱

38、使用过程中，会由于各种原因导致分离失败或色谱柱失效，常见问色谱柱使用过程中，会由于各种原因导致分离失败或色谱柱失效，常见问题包括：色谱柱反压增加；谱峰拖尾；塔板数下降；保留值减小等。原因主要题包括：色谱柱反压增加；谱峰拖尾；塔板数下降；保留值减小等。原因主要有几种：进口筛板或者柱床部分堵塞；吸附样品杂质等污染物；柱填充不良；有几种：进口筛板或者柱床部分堵塞；吸附样品杂质等污染物；柱填充不良；机械及热冲击造成柱床断层；基质或固定相化学破坏。机械及热冲击造成柱床断层；基质或固定相化学破坏。色谱柱滤板问题色谱柱滤板问题：色谱柱入口筛板堵塞是色谱柱最常见的问题之一，最直：色谱柱入口筛板堵塞是色谱柱最常见的问题之一，最直接的判断方法是压力升高。解决办法：注入样品前过滤或者离心，也可以用装接的判断方法是压力升高。解决