发酵工程试验报告之果胶酶

1、YUNNANNORMALUNIVERSITY发酵工程学实验姓名：刘云谣学号：124120434学院：生命科学学院专业、班级：12生物技术实验课程名称_发酯工程实验指导教师及职称唐湘华开课学期2014至2015学年下学期云南师范大学教务处编印实验名称：(一)特定产物工业生产菌种发醉及应用性质研究实验时间第十三周实验室睿智3-121小组合组是小组成员一、实验目的：1、掌握菌种选育、菌种发醉条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.二、实验原理：1、理论依据(1)、果胶酶概况(2)、果胶酶的酶活测定方法(3)、微生物发酵生产特定产物受培养基成分、培养条件和附加条件等的制约(

2、4)、酶催化反应的进行受多种因素的影响2、果胶酶概况果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。3、果胶酶的酶活测定方法粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。次亚碘酸法：用滴定法

3、定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。还原糖法（DNS法）：测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。DNS法：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3, 5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。4、微生物发酵生产产品受以下条件制约：培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子培养条件：温度、pH溶解氧等附加条件：诱导物、表面活性剂等5、酶催化反应的进行受多种因素的影响底物浓度酶浓度温度pH激活剂抑制剂三、实验材料（一）试剂1 、酶活测定用试剂和DN

4、S2 、新鲜果汁（二）仪器烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等;天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。（三）培养基1、菌种筛选使用2、黑曲霉Asp-2固体发酵用1、菌种筛选使用培养基基本培养基：果胶1%,磷酸氢二钠0.5%,蛋白月东1%pH4.5,琼脂2.0%。分离培养基果胶0.5%,磷酸氢二钠0.5%,琼脂2.0%,pH4.5（3）发酵培养基果胶1%,磷酸氢二钠0.5%,蛋白月东1%pH4.5。2、黑曲霉Asp-2固体发酵培养基菌种斜面培养基（查氏培养基）NaNO30.2%K2HPO40.1%KCl0.05%MgSO

5、40.05%FeSO40.001%蔗糖3%琼脂2.5%自然pH种子培养基秋皮3.0%,橘子粉2.0%,硫酸镂0.5%,葡萄糖1%,KH2PO40.1%pH4.5固体发酵培养基：5瓶/组萩皮10g,橘子粉2.5g,（NH4）SO40.1g（0.8%干料计）葡萄糖0.125g（1%F料计），水15ml要求：按组统一配制后分装三角瓶先将（NH4）SO4、葡萄糖用水溶解，再加其它。四、实验方法、步骤及注意事项：（一）固体发酵果胶酶1、菌种准备菌种活化：试管保存菌种-斜面活化-30c培养约60h液体培养：将菌种接种入装有50mL种子培养基的250m一角并K内，30C,200rpm,培养约40h,备用。2

6、、氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响（第一组）选择硫酸镂、蛋白月东、牛肉膏按照1麻度替换发酵培养基中的蛋白月东，接种5喊体种子，培养48小时，测定酶活。在发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0验H2.5%（按干料计）浓度的已选择的氮源，保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（约5%即1.5ml）相同培养条件下（30C,60h）发酵，测定酶活。3、碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响（第二组）选择果胶、葡萄糖、橘子粉按照1麻度替换发酵培养基中的蛋白月东，接种5喊体种子，培养48小时，测定酶活。在液体发酵培养基中分别添加0、0.5%、1.0、2%3.%的选择的碳源，保持

7、培养基的其它成分不变，在相同条件下接种液体种子（约5%即1.5ml）,相同培养条件下，30C,发酵60h,测定酶活。4、培养基含水量对产酶的影响（第三组）在发酵培养基中加入蒸储水，使培养基中的含水量分别约为50%55%60%65%口70%保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（5%，即1.5ml）相同培养条件下（30C,4860h）发酵，测定酶活。5、接种量对产酶的影响（第三组）分别以4%5%6%7%口8%勺接种量接种果胶酶产生菌于发酵培养基中，在相同的培养条件下（30C,4860h）发酵，测定酶活。注意：由于接种的是液体菌种，所以在配制培养基时要将接种时多出的水分去掉。6、发酵时间对产酶的影

8、响（第四组）在相同的培养基、相同的接种量（5%即1.5ml）和相同培养条件下（30C）分别发酵36、48、60、72和84h,测定酶活。注意：精确计算时间，准时取出发酵产物。7、发酵温度对产酶的影响（第五组）保持培养基成分和接种量（5%,即1.5ml）不变，分别在室温、30、37和45c的温度条件下发酵48-60h,测定酶活。先把培养箱调到相应的温度！8、果胶酶酶活的测定（1）待测酶液的制备烘干：把发酵产物倒于平皿中，45C烘干过夜；制备酶粉：将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状（尽量磨细），装于塑料袋中备用；制备酶液：称取0.1g酶粉，充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（稀释100倍），纱

9、布（4层）过滤去除杂质；如果测定所得OD值不在有效值（0.2-0.6）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。（2）果胶酶酶活测定方法操作赤彝互白管样品管A样品管B步聚1吸取L&nL果胶底物溶液吸取L8mL果胶底物溶液吸取1.8mL果胶底物溶液步啸H3MC保温5分钟37P保温5分钟371保温5分钟步聚？加入特测酹液0.2毫升加入特测酶液。.2亳升步骤437七精确保温37七精确保温EOmin37七精确保温30min步啜5加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应步骑6混合均匀混合均匀混告均匀步霖7加入0.2亳升待测醇液，沸水浴煮沸5mH沸水浴煮沸

10、5min沸水浴煮沸5min出?雅区流水心却流水冷却流水冷却米麟9加蒸缩水15mL,混匀加蒸储水15mL混匀加蒸懦水15mL,混匀步碟0D540nm比色0D54gnm比色OD540nm比色OD=（A+B）/2酶活定义：在pH3.0、37c条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1pmo半乳糖醛酸所需要的酶量为一个酶活单位U/g。酶活计算公式酶活（U/g）=AX5XKXNX1000/（TXW2.01.81.G1.41.21.00.8DNS(ml)3333333定容总体积(mi)202。202。202。20OD0.00o0.0850.2410.4050.55O0.7030.850Y=130651X+0.

11、08280R=0.999831.MCI-D.M0-oeco-D.00-D.2Da-1I1I1I1I11I1I11I-D.OD0.1D0.200.300400.50D.60Q7QQ.00,90。口侦(3)注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理;避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；实验结果的记录与分析9、仪器的使用恒温水浴锅分光光度计烘箱移液枪UV2000型分光光度计的使用注意提前

12、半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检；将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室；调节测定所用波长；读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30%酒精中。注意事项1、接种接种方式是液体-固体，用灭菌的移液管或10ml量筒接种或大枪头；接种后振荡接种瓶，使菌种充分与固体培养基混合。2、水浴锅的使用：水量(蒸储水)要超过试管中的液面3、分光光度计使用时注意：测定OD在540nm、以对照为参比、测定吸光值4、及时清洗用过的枪头实验准备内容(1)黑曲霉Asp-2固体发酵用的培养基固体发酵培养基：5瓶/组一注意配方等的不同，做好标记！（2）灭菌培养基其它：10ml量筒（纱布和报纸包口）、移液管（塞棉花）等时间：灭菌45min注意事项1、酶粉的选择：同一大组采用同一酶粉进行应用性质的实验!2、水浴锅的使用水浴锅的水量（蒸储水）要超过试管中的液面各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行3、分光光度计使用时注意OD660nm以蒸储水为参