第4章 蛋白质一级结构测定

1、第四章第四章 蛋白质结构测定蛋白质结构测定数年后，美国科学家数年后，美国科学家 Moore和和 Stein 改进了改进了Sanger 的方法，完成了第一个酶蛋白的方法，完成了第一个酶蛋白核核糖核酸酶的序列分析。糖核酸酶的序列分析。1955年英国科学家年英国科学家FSanger发表了胰岛素发表了胰岛素的全部氨基酸排列顺序，开创了研究蛋白质的全部氨基酸排列顺序，开创了研究蛋白质一级结构的新纪元。这是分子生物学发展进一级结构的新纪元。这是分子生物学发展进程中的一个重要突破。程中的一个重要突破。第第四四章章 蛋白质一级结构测定蛋白质一级结构测定 第一节第一节 蛋白质序列测定的基本策略和步骤蛋白质序列测

2、定的基本策略和步骤第二节第二节 蛋白质和肽的氨基酸组成分析蛋白质和肽的氨基酸组成分析 第三节第三节 末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定 第四节第四节 肽链的专一性水解和肽段的分离纯化肽链的专一性水解和肽段的分离纯化 第五节第五节 肽段的序列测定肽段的序列测定 第六节第六节 由已知序列肽段建立蛋白质一级结构由已知序列肽段建立蛋白质一级结构第七节第七节 蛋白质一级结构研究进展蛋白质一级结构研究进展第一节第一节 蛋白质序列测定的基本蛋白质序列测定的基本策略和步骤策略和步骤 一、序列测定的基本策略一、序列测定的基本策略二、序列测定前的准备工作二、序列测定前的准备工作三、序列测定的一般步骤三、序列测定的一

3、般步骤一、序列测定的基本策略一、序列测定的基本策略1. 两种或两种以上的特异性裂解法两种或两种以上的特异性裂解法 2. 逐级特异性裂解逐级特异性裂解战略考虑关键战略考虑关键一是多肽链片断裂解一是多肽链片断裂解方法的选择；方法的选择；二是裂解后肽段的分二是裂解后肽段的分离纯化；离纯化；三是要寻找接头肽段。三是要寻找接头肽段。 二、序列测定前的准备工作二、序列测定前的准备工作（一）（一）样品的纯度要求样品的纯度要求 （二）（二）蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量测定（三）（三）构成蛋白质的多肽链的数目和大小构成蛋白质的多肽链的数目和大小（四）蛋白质的氨基酸组成（四）蛋白质的氨基酸组成 （五）蛋白质的

4、配基（五）蛋白质的配基 （六）蛋白质的末端分析（六）蛋白质的末端分析 蛋白质一级结构测定蛋白质一级结构测定(重点重点)指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置。测定的基本步骤：测定的基本步骤：（一）测定蛋白质纯度、分子量和浓度（一）测定蛋白质纯度、分子量和浓度 （二）进行末端分析，确定蛋白质的肽链数目及（二）进行末端分析，确定蛋白质的肽链数目及N-N-端和端和C-C-端氨基酸的种类端氨基酸的种类（三）拆开二硫键并分离出每条多肽链（三）拆开二硫键并分离出每条多肽链（四）分析每条多肽链的（四）分析每条多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端残

5、基组成和摩末端残基组成和摩尔数尔数（五）用两种不同方法将肽链专一性地水解成两套肽段（五）用两种不同方法将肽链专一性地水解成两套肽段并进行分离，以获得单一的碎片并进行分离，以获得单一的碎片（六）比较各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽（六）比较各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽链的氨基酸排列顺序链的氨基酸排列顺序（七）二硫键和酰胺基位置的确定（七）二硫键和酰胺基位置的确定（一）样品的纯度要求（一）样品的纯度要求 一般要求纯度在一般要求纯度在97以上，杂蛋白含量超过以上，杂蛋白含量超过5时便很难测定序列时便很难测定序列 。 常用来检测蛋白质样品均一性的方法有：常用来检测蛋白质样品均一性的方法

6、有： 双向分析电泳；双向分析电泳； 变性聚丙烯酰氨凝胶电泳；变性聚丙烯酰氨凝胶电泳； 离子交换层析；离子交换层析； N 末端氨基酸的测定；末端氨基酸的测定； 亲和层析；亲和层析； 纯化至恒定比活；纯化至恒定比活； 肽（酶）谱分析；肽（酶）谱分析； Western 印渍法等。印渍法等。（一）测定蛋白质纯度、分子量和氨基酸组成（一）测定蛋白质纯度、分子量和氨基酸组成1、 样品的纯度与分子量样品的纯度与分子量纯度纯度97%；测定方法：测定方法：（1） SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶知识

7、凝胶知识丙烯酰胺丙烯酰胺（acrylamide），），甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（methylenebisacrylamide）聚合而成；聚合而成； 凝胶孔径：凝胶孔径：选择丙烯酰胺浓度，甲叉双丙烯酰胺胶联剂的选择丙烯酰胺浓度，甲叉双丙烯酰胺胶联剂的浓度；浓度； 凝胶有分子筛效应。凝胶有分子筛效应。SDS-PAGESDS（sodium dodecyl sulfate）阴离子洗涤剂，几乎能破坏天然蛋白质中所有的非共阴离子洗涤剂，几乎能破坏天然蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸价键，从而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率展状态，消除了蛋

8、白质形状对迁移率（migration rate）的影响；的影响；SDS 以以 1:2 1:2 的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，而且电荷量与蛋变性蛋白质带上大量的净负电荷，而且电荷量与蛋白质分子量（即肽链长度）成正比。所以白质分子量（即肽链长度）成正比。所以分子量成分子量成为决定蛋白质迁移率的唯一因素。为决定蛋白质迁移率的唯一因素。SDS -PAGE SDS-PAGE 分离的蛋白分离的蛋白质可以用质可以用 Coomassie blue 染色，也可银染染色，也可银染（silver stain） SDS-PAGE 能分离分能分离分子量

9、差异小于子量差异小于 10% 的的蛋白质蛋白质 用于蛋白质纯化和分子用于蛋白质纯化和分子量近似值测定量近似值测定（2）等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing ，IEF ）在凝胶上加入一种两性电解质在凝胶上加入一种两性电解质（ampholyte），），电泳时会电泳时会形成连续的形成连续的 pH pH 梯度梯度电泳后，各种电泳后，各种蛋白质停留在与其等电点蛋白质停留在与其等电点（pI）相同的位相同的位置置IEF 能分离能分离 pI 值仅相差值仅相差 0.01 0.01 的蛋白质（即一个净电的蛋白质（即一个净电单位）单位）不连续不连续电泳的电泳的三种效应三种效应： 浓缩效应，浓缩

10、效应， 分子筛效应分子筛效应 电荷效应电荷效应（3）双向电泳）双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）双向电泳双向电泳 = = IEF + SDS-PAGE 第一向：第一向：根据电荷差异用根据电荷差异用 IEF 分离分离 第二向：第二向：根据分子量差异用根据分子量差异用 SDS- PAGE 分离分离IEFSDS-PAGE每一个点代表一条多肽链，每一条多肽链有自己的等电每一个点代表一条多肽链，每一条多肽链有自己的等电点和分子量。多肽链可以用染色法或放射自显影进行检点和分子量。多肽链可以用染色法或放射自显影进行检测测（4）其它方法）其它方法 离子交换层析离

11、子交换层析（根据物质所带电荷进行分离）（根据物质所带电荷进行分离） 亲和层析亲和层析（利用蛋白质与与其他分子的结合特异性）（利用蛋白质与与其他分子的结合特异性） 末端氨基酸测定末端氨基酸测定 纯化至恒定比活纯化至恒定比活 肽（酶）谱分析肽（酶）谱分析 Western 印迹法印迹法（由蛋白质的（由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂、电转及杂交几部分组成）交几部分组成）2、浓度测定、浓度测定紫外吸收法紫外吸收法蛋白质蛋白质（ ug/ ml ）（）（ 1.45A 280 一一 0.74A 260 ） X 稀释倍数稀释倍数显色法显色法双缩脲法：双缩脲法：Cu2+Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络

12、合，形成与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝紫蓝色色络合物，此物在络合物，此物在540nm540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L10g/L含量的蛋白质溶液测定。含量的蛋白质溶液测定。干扰物干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%10%冷的三氯醋酸沉淀蛋冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH1m NaOH溶解沉淀的蛋溶解沉淀的蛋白质进行定量

13、测定白质进行定量测定Lowry法法 即即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物（与蛋白质在碱性溶液中形成络合物（双缩脲反应双缩脲反应），然后这个络合物还原磷钼磷，然后这个络合物还原磷钼磷- -磷钨酸试剂（福林磷钨酸试剂（福林- -酚酚试剂），结果得到深蓝色物，于试剂），结果得到深蓝色物，于nmnm下达到最大下达到最大吸收峰。吸收峰。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L20mg/L400mg/L400mg/L含量的蛋白质溶液。含量的蛋白质溶液。干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大 考马斯（考马斯（Co

14、messie)Comessie)亮蓝结合法亮蓝结合法 原理：考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种原理：考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250 的最大光吸收的最大光吸收峰在峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为大吸收峰改变为595nm。 微量法测定蛋白含量范围为微量法测定蛋白含量范围为1-10g1-10g；常量法测以检测范；常量法测以检测范围围10-10010-100gg为宜为宜 干扰物质较少干扰物质较少（二）蛋白质的分子量测定（二）蛋白质的分子量测定 常用的

15、测定方法有：常用的测定方法有：1. 渗透压（渗透压（osmotic pressure）2. 沉降平衡（沉降平衡（sedimentation equilibrium）3.凝胶过滤法；凝胶过滤法；4. SDS 聚丙烯酸胺凝胶电泳法聚丙烯酸胺凝胶电泳法5. 激光解吸电离飞行质谱法激光解吸电离飞行质谱法分子量测定分子量测定公式：公式：/ c = RT / M + K c. . 渗透压渗透压（osmotic pressure）：渗透压：渗透压 c：溶质浓度：溶质浓度 R：气体常数：气体常数 T：绝对温度：绝对温度 M：分子量：分子量 同时测定几个不同浓度的渗透压，以同时测定几个不同浓度的渗透压，以/ c

16、 / c 对对 c c 作图并外作图并外推到蛋白质浓度为零，得截距，从而求出推到蛋白质浓度为零，得截距，从而求出 M M。 为避免为避免 pH pH 值的影响，在溶解度允许的范围内，值的影响，在溶解度允许的范围内，尽量采用等尽量采用等电点或接近等电点的缓冲液电点或接近等电点的缓冲液，并增加溶液中无机盐的浓度。，并增加溶液中无机盐的浓度。 可以测分子量在可以测分子量在 1 11010万范围的蛋白质。万范围的蛋白质。 实验装置简单，准确度高。但实验装置简单，准确度高。但不能区别溶液中蛋白质分子是不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。否均一。. . 沉降平衡沉降平衡（sedimentationequil

17、ibrium）公式：公式：M =2RT ln(c2/c1)(1-v ) 2 (x22-x12)x：蛋白质界面到旋转中蛋白质界面到旋转中 心的距离心的距离 c： x 处的蛋白质浓度处的蛋白质浓度 ：溶剂的密度溶剂的密度 ：角速度角速度v：蛋白质的偏微比容蛋白质的偏微比容 用较低的速度离心用较低的速度离心（8,00020,000 r/min） 离心开始后，颗粒发生沉降，造成浓度梯度，同时产生离心开始后，颗粒发生沉降，造成浓度梯度，同时产生扩散作用。扩散力与离心力作用方向相反，相互平衡扩散作用。扩散力与离心力作用方向相反，相互平衡1 11gM=A-BV1gM=A-BVe eB B为斜率，为斜率，A

18、A为截距。当条件一定时，为截距。当条件一定时，B B与与A A均均为常数为常数2 2A-BA-BB B为斜率，为斜率，A A为截距。当条件一定时，为截距。当条件一定时，B B与与A A均均为常数为常数3 3分子分子（三）构成蛋白质的多肽链的数目和大小（三）构成蛋白质的多肽链的数目和大小1. 若肽链之间非共价交联，可用高浓度变若肽链之间非共价交联，可用高浓度变性剂（如性剂（如8molL尿素或尿素或6molL盐酸胍）盐酸胍）变性拆离变性拆离2. 若肽链是由二硫键共价交联，可用过量若肽链是由二硫键共价交联，可用过量的巯基乙醇等断裂二硫键，同时加变性的巯基乙醇等断裂二硫键，同时加变性剂，并保护生成的巯

19、基剂，并保护生成的巯基拆开二硫键方法之一拆开二硫键方法之一过甲酸氧化法过甲酸氧化法 为避免副反应，一般在为避免副反应，一般在 10下进行反应，下进行反应，但但Trp仍被破坏，仍被破坏，Met氧化成亚砜。此法的氧化成亚砜。此法的优点是，切断二硫键后，不能重新形成二硫优点是，切断二硫键后，不能重新形成二硫键，便于肽键分离。键，便于肽键分离。 用得最多的还原剂是巯基乙醇、巯基乙酸、用得最多的还原剂是巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇、连四硫酸钠等。二硫苏糖醇、连四硫酸钠等。为使反应完全，还原剂要过量，同时在反为使反应完全，还原剂要过量，同时在反应体系中加入变性剂（应体系中加入变性剂（SDS、脲、胍等）。

20、、脲、胍等）。在烷基化之前，还原的巯基要用在烷基化之前，还原的巯基要用N2保护。保护。用碘乙酸（或其酰胺），环乙烯亚胺封闭用碘乙酸（或其酰胺），环乙烯亚胺封闭新生成的巯基，使巯基烷基化避免二硫键新生成的巯基，使巯基烷基化避免二硫键重新形成。重新形成。巯基保护巯基保护 还原还原-羧甲基化法羧甲基化法 (四四) 蛋白质的氨基酸组成蛋白质的氨基酸组成（五）蛋白质的配基（五）蛋白质的配基 （六）蛋白质的端基分析（六）蛋白质的端基分析三、序列测定的一般步骤三、序列测定的一般步骤 正常的序列测定包括以下步骤：正常的序列测定包括以下步骤：1. 先是根据肽段大小和氨基酸组成情况选择合适的裂解肽段试剂，先是根据

21、肽段大小和氨基酸组成情况选择合适的裂解肽段试剂， 将多肽链裂解成一系列小肽，并分离纯化这些小肽段；然后测定将多肽链裂解成一系列小肽，并分离纯化这些小肽段；然后测定 每一肽段的氨基酸序列；每一肽段的氨基酸序列；2. 另取一份样品，用第二种方法裂解多肽链（切点位置与第一次不另取一份样品，用第二种方法裂解多肽链（切点位置与第一次不同），分离纯化各肽段后，测每一肽段的氨基酸序列；同），分离纯化各肽段后，测每一肽段的氨基酸序列；3. 最后比较已测得的两套肽段的序列，找出前后两次断裂点相重叠最后比较已测得的两套肽段的序列，找出前后两次断裂点相重叠的部位，即接头部位，即可排出多肽链完整的氨基酸排列顺序。的部

22、位，即接头部位，即可排出多肽链完整的氨基酸排列顺序。 对于一次不能连续测出序列的大肽段，还需继续裂解成小肽，对于一次不能连续测出序列的大肽段，还需继续裂解成小肽，并分离纯化，分别测出这些次级肽段的序列。若多肽链含有二硫并分离纯化，分别测出这些次级肽段的序列。若多肽链含有二硫键或其它配基，如酰胺基时，还需分别确定它们在序列中的连接键或其它配基，如酰胺基时，还需分别确定它们在序列中的连接位置。位置。 第二节第二节 蛋白质和肽的氨基酸组成分析蛋白质和肽的氨基酸组成分析 一、蛋白质的水解一、蛋白质的水解 二、氨基酸的分离和定量测定二、氨基酸的分离和定量测定 三、特殊氨基酸的测定三、特殊氨基酸的测定 一

23、、蛋白质的水解一、蛋白质的水解 （一）（一）盐酸水解法盐酸水解法 （二）（二）磺酸水解法磺酸水解法 （三）（三）酶水解法酶水解法 能较满意地得到除能较满意地得到除TrpTrp和和CysCys以外的其以外的其它所有氨基酸它所有氨基酸（一）盐酸水解法（一）盐酸水解法 盐酸水解是目前水解蛋白质或多肽应用盐酸水解是目前水解蛋白质或多肽应用最广泛的一种方法。用此法能较满意地最广泛的一种方法。用此法能较满意地得到除得到除TrpTrp和和CysCys以外的其它所有氨基酸，以外的其它所有氨基酸，方法也较为简便。方法也较为简便。 存在的问题存在的问题使用重蒸使用重蒸 5.7 mol5.7 molL L恒沸点盐酸

24、，在密封的水恒沸点盐酸，在密封的水解管中，于解管中，于 105105110110进行蛋白质水解。水解进行蛋白质水解。水解时间一般在时间一般在24247272小时。结果，小时。结果，大部分氨基酸可大部分氨基酸可定量回收定量回收；但是，；但是，TrpTrp基本上全被破坏基本上全被破坏，必须用，必须用其它方法测定；其它方法测定；SerSer和和ThrThr缓慢分解，缓慢分解，要准确测定，要准确测定，需要做几个水解时间实验；需要做几个水解时间实验；含含ValVal和和IleIle的肽键，的肽键，由于支链的空间障碍而水解缓慢由于支链的空间障碍而水解缓慢，所以，定量测，所以，定量测定就要长时间水解；定就要

25、长时间水解；CysCys可被部分破坏和氧化可被部分破坏和氧化，所以最好在氧化成稳定的磺基丙氨酸后测定；所以最好在氧化成稳定的磺基丙氨酸后测定；GlnGln和和AsnAsn在酸水解时脱酰胺后全部变成在酸水解时脱酰胺后全部变成GluGlu和和AspAsp，水解时放出的氨量可用来测定水解时放出的氨量可用来测定AsnAsn和和GlnGln的总量，的总量，或者用不水解酰胺的方法水解肽键后直接测定。或者用不水解酰胺的方法水解肽键后直接测定。 盐酸水解时，盐酸水解时，MetMet易被氧化转变为甲硫易被氧化转变为甲硫氨酸砜氨酸砜，损失约，损失约2020 左右，可以用这一数左右，可以用这一数值进行校正，也可用保

26、护剂（在盐酸中加值进行校正，也可用保护剂（在盐酸中加入入0.l0.l1.01.0巯基乙酸）来减少水解中巯基乙酸）来减少水解中 Met Met 的损失的损失; ; Tyr Tyr 的破坏率约为的破坏率约为 1010，如，如水解时加入水解时加入 0.l0.l1.01.0 巯基乙酸和巯基乙酸和 0.050.050.l0.l苯酚，能使苯酚，能使TyrTyr和和 SerSer回收率回收率明显提高，这时明显提高，这时 MetMet也能免遭破坏。也能免遭破坏。 碱水解碱水解一般用一般用5mol/L5mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-2010-20小时。小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏

27、，产由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。率不高。部分的水解产物发生消旋化。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是该法的优点是色氨酸色氨酸在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。（二）磺酸水解法（二）磺酸水解法 用用 4 mol4 molL L甲基磺酸，内含甲基磺酸，内含0.20.2 吲哚基乙胺（色胺）作水解剂，可使吲哚基乙胺（色胺）作水解剂，可使 TrpTrp的回收率达到的回收率达到9090以上，以上，SerSer和和ThrThr的的回收率接近定量值。其中回收率接近定量值。其中CysCys可用二硫苏可用二硫苏糖醇还原水解液中的胱氨酸及其衍生物，糖醇还原水解液中的胱氨酸及其衍生物

28、，然后用过量的连四硫酸钠氧化，得到然后用过量的连四硫酸钠氧化，得到 S S 磺基半胱氨酸而加以测定。磺基半胱氨酸而加以测定。 磺酸水解也有局限性磺酸水解也有局限性，当水解液中存在，当水解液中存在碳水化合物时，色氨酸容易破坏，因此碳水化合物时，色氨酸容易破坏，因此对含有较多碳水化合物的糖蛋白分子不对含有较多碳水化合物的糖蛋白分子不能用本方法测定色氨酸。本法的最大优能用本方法测定色氨酸。本法的最大优点是中性水解液可直接上机，色氨酸较点是中性水解液可直接上机，色氨酸较稳定稳定 （三）酶水解法（三）酶水解法 选用专一性低，水解酶选用专一性低，水解酶活力高的蛋白酶活力高的蛋白酶水解。水解。 主要缺点：不

29、易达到彻底水解，主要缺点：不易达到彻底水解，影响氨影响氨基酸的回收率；基酸的回收率；蛋白酶自溶产物蛋白酶自溶产物会污染会污染水解的氨基酸混合物。水解的氨基酸混合物。 目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶或称蛋白目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶或称蛋白酶（酶（proteinaseproteinase）已有十多种。应用酶水解多肽）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。物为较小的肽段。 二、氨基酸的分离和定量测定二、氨基酸的分离和定量测定 当前使用最普遍、最有效的是当前使用最普遍、最有效的是以离子交换层以离子交换

30、层析法为基础研制的氨基酸自动分析仪析法为基础研制的氨基酸自动分析仪，也有，也有用用HPLC的。使用的柱材料是磺酸型聚苯乙烯的。使用的柱材料是磺酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂。在阳离子交换树脂。在pH2.0 的条件下，全部氨的条件下，全部氨基酸都能牢固地结合在树脂上。提高洗脱液基酸都能牢固地结合在树脂上。提高洗脱液的的pH和离子强度，可将氨基酸依次洗脱下来，和离子强度，可将氨基酸依次洗脱下来，从而达到分离的目的。从而达到分离的目的。洗下的氨基酸与茚三酮反应形成紫色产物洗下的氨基酸与茚三酮反应形成紫色产物Ruheman紫，可于紫，可于570nm比色测定。但比色测定。但Pro与与茚三酮反应形成的产物为黄

31、色，于茚三酮反应形成的产物为黄色，于440nm比比色测定。色测定。 分离分离定量定量测定测定1717种标准氨基酸混合液在日立种标准氨基酸混合液在日立 835 835 50 50 型氨型氨基酸自动分析仪上的分析图谱基酸自动分析仪上的分析图谱 三、特殊氨基酸的测定三、特殊氨基酸的测定 （一）（一）色氨酸（色氨酸（Trp）的测定）的测定 （二）（二）巯基测定巯基测定 （三）（三）二硫键的测定二硫键的测定（四）（四）氨基的测定氨基的测定 （一）色氨酸（一）色氨酸（Trp）的测定）的测定 1紫外吸收法紫外吸收法 2对对 二甲基氨基苯甲醛法二甲基氨基苯甲醛法 Trp在强酸条件下与醛反应生成带色产在强酸条件

32、下与醛反应生成带色产物。颜色的深浅与物。颜色的深浅与Trp含量成直线关系。该带含量成直线关系。该带色物质的最大吸收峰位在色物质的最大吸收峰位在590nm。该法已广泛。该法已广泛采用，结果较可靠。采用，结果较可靠。返回由于由于TrpTrp和和TyrTyr在在 280 nm 280 nm 和和 290 nm 290 nm 的紫外区有光的紫外区有光吸收，因此可用完整的蛋白质样品进行吸收，因此可用完整的蛋白质样品进行TrpTrp测定。先测定。先将蛋白质样品溶于将蛋白质样品溶于6mol6molL L盐酸胍溶液中，然后分别盐酸胍溶液中，然后分别在在280 nm280 nm和和 288 nm 288 nm

33、测量蛋白质溶液的光吸收。测量蛋白质溶液的光吸收。TrpTrp在在 288 nm 288 nm 和和 280nm 280nm 的摩尔消光系数分别是的摩尔消光系数分别是 4815 4815 和和56905690；而；而TyrTyr在在288nm 288nm 和和 280nm 280nm 的摩尔消光系数的摩尔消光系数分别是分别是385385和和 12801280。根据测定混合物中两种物质浓。根据测定混合物中两种物质浓度的比尔定律，可得两个联立方程，稍加整理，则度的比尔定律，可得两个联立方程，稍加整理，则可得到可得到TrpTrp与与TyrTyr之比：之比： 回上页（二）巯基测定（二）巯基测定 测定巯基

34、的主要方法有形成硫醇盐法，烷基化法测定巯基的主要方法有形成硫醇盐法，烷基化法和比色法。比色法简单易行。这类方法是根据试和比色法。比色法简单易行。这类方法是根据试剂与巯基反应后生成带色产物来进行测定的。剂与巯基反应后生成带色产物来进行测定的。 1. 5.5 二硫代双（二硫代双（2 硝基苯甲酸）（硝基苯甲酸）（DTNB） 测定法测定法 反应后产生反应后产生 4硝基硝基3羟基硫酚，可用半胱氨羟基硫酚，可用半胱氨酸作标准样品，在酸作标准样品，在412nm处测定处测定2. 萘醌测定法萘醌测定法 萘醌与巯基有当量加成关系，加成物在萘醌与巯基有当量加成关系，加成物在420nm 左左右有吸收峰、标准物和未知物

35、在相同条件下测定。右有吸收峰、标准物和未知物在相同条件下测定。 返回（三）二硫键的测定（三）二硫键的测定 1Ellman 试剂法试剂法 当有一游离巯基存在时，当有一游离巯基存在时， Ellman 试剂（结构类似于试剂（结构类似于DTNB）可与）可与二硫键发生反应二硫键发生反应 ，而进行测定，而进行测定22 硝基硝基 5 硫代苯磺酸法（硫代苯磺酸法（NTSB） 过量亚硫酸钠与蛋白质反应可裂解蛋白过量亚硫酸钠与蛋白质反应可裂解蛋白 质中的二硫键，而进行测定质中的二硫键，而进行测定 返回拆开拆开-S-S-S-S-的方法的方法 （1 1）二硫键的断裂）二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在几

36、条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L8mol/L尿素尿素或或6mol/L6mol/L盐酸胍盐酸胍存在下，用过量的存在下，用过量的- -巯基乙醇巯基乙醇处理，使处理，使二硫键二硫键还原为巯基还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以基，以防止它重新被氧化防止它重新被氧化。（2 2）二硫键的切割与保护）二硫键的切割与保护切割切割 过甲酸过甲酸performic acidperformic acid 不可逆不可逆，还原氧化还原氧化 不可逆不可逆 巯基乙醇，巯基乙醇，DTT DTT 碘乙酸碘乙酸 S-CH2-COOHS-CH2-COOH亚硫酸分解亚硫酸分解S

37、ulfitolysisSulfitolysis 可逆可逆R1-S-S-R2 R1-S-S-R2 HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3 （四）氨基的测定（四）氨基的测定 1.常用常用2，4，6 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）进行测定，）进行测定，此法此法比较灵敏。在温和条件下试剂即能与伯胺定量反应，产比较灵敏。在温和条件下试剂即能与伯胺定量反应，产物可用分光光度法定量测定。物可用分光光度法定量测定。 2. 采用荧光胺测定氨基，采用荧光胺测定氨基，灵敏度大为提高，可测定灵敏度大为提高，可测定pmole数数量级的氨基。产生的荧光团可在量

38、级的氨基。产生的荧光团可在390nm 被激发，在被激发，在475nm 发出荧光。荧光强度与伯胺浓度成正比。肽在发出荧光。荧光强度与伯胺浓度成正比。肽在pH7能产生最大的荧光强度。荧光胺反应的一个优点是游能产生最大的荧光强度。荧光胺反应的一个优点是游离氨的干扰极微。离氨的干扰极微。3. 用邻苯二醛用邻苯二醛 2 - 巯基乙醇测定伯胺，巯基乙醇测定伯胺，比荧光胺的灵比荧光胺的灵敏度高敏度高510倍。试剂与伯胺生成强荧光产物，可在倍。试剂与伯胺生成强荧光产物，可在340nm 被激发，在被激发，在455nm 测量荧光。测量荧光。 返回第三节第三节 末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定 一、一、N N 末端

39、的测定末端的测定二、二、C C 末端的测定末端的测定一、一、N 末端的测定末端的测定 N N 端测定法（除氨肽酶外）的共同特点是在端测定法（除氨肽酶外）的共同特点是在 N N 端引入具有一定基团的标记化合物。这种标记端引入具有一定基团的标记化合物。这种标记基团有颜色，荧光，紫外吸收等性质，然后分离基团有颜色，荧光，紫外吸收等性质，然后分离鉴定具有这种基团的氨基酸衍生物。鉴定具有这种基团的氨基酸衍生物。 （一）（一）二硝基氟苯法二硝基氟苯法 （二）（二）丹磺酰氯分析法丹磺酰氯分析法 （三）异硫氰酸苯酯法（三）异硫氰酸苯酯法 （四）（四）DABITC法法 （五）氨肽酶法（五）氨肽酶法 （六）（六）

40、封闭封闭 N 端的测定端的测定 1950 1950年提出的，也称年提出的，也称EdmanEdman降解法，其最大降解法，其最大优点是可以连续降解，优点是可以连续降解，见第五节见第五节 原理类似于原理类似于EdmanEdman降解反应。检降解反应。检出灵敏度可靠，见第五节出灵敏度可靠，见第五节 （一）二硝基氟苯法（一）二硝基氟苯法黄色黄色DNPDNP氨基酸衍生物，可用乙醚抽提氨基酸衍生物，可用乙醚抽提DNP-DNP-氨基酸见光易分解，整个操作应在暗处进行氨基酸见光易分解，整个操作应在暗处进行检测不出检测不出DNP DNP 氨基酸的可能原因氨基酸的可能原因 被分析对象的被分析对象的 N N 端是封

41、闭的端是封闭的 因为因为DNPDNPProPro或或DNP DNP GlyGly在盐酸水解条件在盐酸水解条件下极不稳定，回收率甚低。这时要缩短水解时间下极不稳定，回收率甚低。这时要缩短水解时间 N N端为端为ProPro或或GlyGly 末端残基很可能是末端残基很可能是ValVal、IleIle 如焦谷氨酰基，乙酰基等如焦谷氨酰基，乙酰基等 它们所形成的肽键对酸水解的耐性强，酸水解它们所形成的肽键对酸水解的耐性强，酸水解后没有产生游离的后没有产生游离的DNP DNP 氨基酸，而生成氨基酸，而生成DNPDNP小肽，可通过延长水解时间来解决这个问题小肽，可通过延长水解时间来解决这个问题（二）丹磺酰

42、氯分析法（二）丹磺酰氯分析法 反应产物反应产物 DNSDNSAA AA 在紫外线下有强烈荧光，检在紫外线下有强烈荧光，检测灵敏度可达测灵敏度可达10109 910101010摩尔，比二硝基氟苯法高摩尔，比二硝基氟苯法高100100倍。倍。荧光试剂荧光试剂 该反应依赖该反应依赖 pHpH，并需过量，并需过量 DansylDansyl Cl Cl 试剂。试剂。HisHis的咪唑基、的咪唑基、CysCys的巯基、的巯基、TyrTyr的酚基和的酚基和 LysLys的的 氨基等也能和试剂反氨基等也能和试剂反应，生成相应的衍生物，但这些物质不影应，生成相应的衍生物，但这些物质不影响响 N N 端端 DNS

43、 DNS 氨基酸的测定。氨基酸的测定。（六）封闭（六）封闭 N 端的测定端的测定 N N端残基受封闭的种类很多，例如端残基受封闭的种类很多，例如乙酰化乙酰化（兔肌红蛋白）、（兔肌红蛋白）、甲酰化甲酰化（蜂毒素）、（蜂毒素）、焦谷氨酰环化焦谷氨酰环化（兔免疫球蛋白）、丙酰（兔免疫球蛋白）、丙酰氨环化及个别多肽形成的环状分子（短氨环化及个别多肽形成的环状分子（短杆菌酪肽杆菌酪肽 A A）等。前三种常见。）等。前三种常见。 除了自然界中许多蛋白质或活性多肽以除了自然界中许多蛋白质或活性多肽以 N N 端氨基封闭的形式存在以外。在一定端氨基封闭的形式存在以外。在一定条件下，条件下，GlnGln（无论是

44、游离的还是处在肽（无论是游离的还是处在肽链链 N N 端）会发生环化反应，形成端）会发生环化反应，形成焦谷氨焦谷氨酰基衍生物酰基衍生物： 目前降解目前降解 N N 末端焦谷氨酰残基的方末端焦谷氨酰残基的方法有法有酶解法酶解法和和化学降解法化学降解法两种两种！封闭端的测定！封闭端的测定种类种类、乙酰化（兔肌红蛋白）；、乙酰化（兔肌红蛋白）；、甲酰化（蜂毒素）；、甲酰化（蜂毒素）；、焦谷氨酰环化（兔免疫球蛋白）；、焦谷氨酰环化（兔免疫球蛋白）；、丙酰氨环化及个别多肽形成的环状分子（短杆菌酪、丙酰氨环化及个别多肽形成的环状分子（短杆菌酪肽）等肽）等 对于对于、，可采用温和酸水解，对还可采取来自可采用

45、温和酸水解，对还可采取来自大肠杆菌的脱甲酰酶除掉；大肠杆菌的脱甲酰酶除掉； 对可采取以下两种方法对可采取以下两种方法焦谷氨酰氨肽酶焦谷氨酰氨肽酶（可专一裂解焦谷氨酰末端）；（可专一裂解焦谷氨酰末端）；化学降解（化学降解（盐酸甲醇试剂盐酸甲醇试剂）酶解法酶解法 焦谷氨酰氨肽酶焦谷氨酰氨肽酶，此酶可专一裂解焦谷氨酰，此酶可专一裂解焦谷氨酰 N N 末端，末端，是裂解是裂解 N N 末端焦谷氨酰残基肽的最有用末端焦谷氨酰残基肽的最有用的办法。此酶已有商品出售。的办法。此酶已有商品出售。 化学降解化学降解 用盐酸用盐酸 甲醇试剂甲醇试剂。在温和条件下，该试剂能。在温和条件下，该试剂能打开焦谷氨酰残基的

46、吡咯烷酮环，暴露其打开焦谷氨酰残基的吡咯烷酮环，暴露其 氨基。氨基。暴露的暴露的 氨基则能被氨基则能被EdmanEdman试剂偶合，然后按正试剂偶合，然后按正常方法降解。用本法降解焦谷氨酰残基，操作简便，常方法降解。用本法降解焦谷氨酰残基，操作简便，效率较高，开环产率达效率较高，开环产率达9090，试剂便宜，是一条优，试剂便宜，是一条优于酶法降解的较好途径。于酶法降解的较好途径。 N N 端甲酰基端甲酰基可通过温和酸水解法除去，而不致可通过温和酸水解法除去，而不致引起肽键严重裂解，或者用来自大肠杆菌的脱甲引起肽键严重裂解，或者用来自大肠杆菌的脱甲酰基酶除掉。酰基酶除掉。 二、二、C 末端的测定

47、末端的测定 C末端残基的测定比末端残基的测定比 N 端残基测定困难。可端残基测定困难。可供选用的方法比较少。化学法中有肼解法、乙内供选用的方法比较少。化学法中有肼解法、乙内酰硫脲法、酰硫脲法、C末端选择性氚标记法，减数末端选择性氚标记法，减数 C 末端末端测定法和还原法。酶法中有羧肽酶法。测定法和还原法。酶法中有羧肽酶法。 （一）（一）肼解法肼解法（二）（二）C 末端选择性氚标记法末端选择性氚标记法 （三）（三）减数减数 C 末端测定末端测定 （四）（四）还原法还原法 （五）（五）羧肽酶法羧肽酶法 （一）肼解法（一）肼解法蛋白质蛋白质无水无水肼肼100510 h+氨基酸的酰肼氨基酸的酰肼 肼解

48、下来的肼解下来的 C C 端氨基酸借助端氨基酸借助 DNFB DNFB 试剂及分级抽试剂及分级抽提等方法，再以层析技术可迅速鉴定出种类和数目。提等方法，再以层析技术可迅速鉴定出种类和数目。C C 端为半胱氨酸和胱氨酸的肽，不能用肼解法测定端为半胱氨酸和胱氨酸的肽，不能用肼解法测定，因为，因为这两种氨基酸在肼解时分解，必须先氧化或烷基化后再这两种氨基酸在肼解时分解，必须先氧化或烷基化后再肼解测定。肼解测定。第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步醋酸酐处理多肽，形成醋酸酐处理多肽，形成 C 端酮环端酮环打开噁唑酮环打开噁唑酮环, C 端氨基端氨基酸的酸的 碳原子已被氚碳原子已被氚（3H）

49、标记）标记酸水解，分离鉴定氚酸水解，分离鉴定氚标记的氨基酸标记的氨基酸（二）（二）C 末端选择性氚标记法末端选择性氚标记法 碱催化噁唑环消旋反应，碱催化噁唑环消旋反应，将氚引入噁唑酮环将氚引入噁唑酮环注：注：不适于不适于C C端为端为 ProPro和和AspAsp（三）减数（三）减数 C 末端测定末端测定 此法是先将肽样品的此法是先将肽样品的 N 端固定端固定在多孔玻璃球在多孔玻璃球上，然后用上，然后用二二 P 硝基苯磷酸酰迭氮化合物硝基苯磷酸酰迭氮化合物（di pnitro phenyl phosphorylazide）处理处理，使，使 C 端羧酸基团转为相应的端羧酸基团转为相应的酰迭氮化酰

50、迭氮化物物，随后再将酰迭氮化物，随后再将酰迭氮化物热解成异氰盐热解成异氰盐。产。产物经物经酸水解酸水解后，使后，使 C 末端残基破坏末端残基破坏。这样可。这样可通过测量反应前后的氨基酸组成变化来确定通过测量反应前后的氨基酸组成变化来确定 C 末端残基。因此，它类似于减数末端残基。因此，它类似于减数Edman降降解法，反应式如下：解法，反应式如下： 仅适用于小肽，且对样品的消耗大，测一个仅适用于小肽，且对样品的消耗大，测一个C C末端末端残基约损耗残基约损耗90%90%以上以上（四）还原法（四）还原法 用硼氢化锂将用硼氢化锂将C末端氨基酸末端氨基酸还原成相还原成相应的应的 氨基醇氨基醇。随后将此

51、肽完全水解。随后将此肽完全水解。水解物中将含有一个相当于原来的水解物中将含有一个相当于原来的 C 末端末端氨基酸的氨基酸的 氨基醇分子，可用色谱法鉴氨基醇分子，可用色谱法鉴别。别。Sanger早年就是用此法鉴定胰岛素早年就是用此法鉴定胰岛素A、B 链的链的 C 端。端。 （五）羧肽酶法（五）羧肽酶法 此法是有效方法也最常用。羧肽酶是一此法是有效方法也最常用。羧肽酶是一类外肽酸，能专一地从肽链的类外肽酸，能专一地从肽链的 C 末端开末端开始逐个降解，释放出游离氨基酸，反应始逐个降解，释放出游离氨基酸，反应如下：如下： 释放出的氨基酸数目和种类随时间发生变化。释放出的氨基酸数目和种类随时间发生变化

52、。可用自动氨基酸分析仪作定性和定量测定，然后可用自动氨基酸分析仪作定性和定量测定，然后根据氨基酸释放的动力学曲线，即以时间为横坐根据氨基酸释放的动力学曲线，即以时间为横坐标，释放的氨基酸量为纵坐标作图，便可确定该标，释放的氨基酸量为纵坐标作图，便可确定该肽链的肽链的 C 端氨基酸的序列端氨基酸的序列 。 C C 端顺序是端顺序是 ThrThrValValPhe Phe 但是，但是，由于羧肽酶对不同侧链基团有极不相由于羧肽酶对不同侧链基团有极不相同的亲和性，所以实际情形要复杂得多同的亲和性，所以实际情形要复杂得多，有时结，有时结果难于解释。但可采取一些步骤使释放不同羧基果难于解释。但可采取一些步

53、骤使释放不同羧基末端的速度更平稳。例如在变性剂存在下使用羧末端的速度更平稳。例如在变性剂存在下使用羧肽酶。羧肽酶在稀肽酶。羧肽酶在稀SDSSDS或或 6mol6molL L脲中是有活性脲中是有活性的，由于变性剂破坏了蛋白质的二、三级结构，的，由于变性剂破坏了蛋白质的二、三级结构，因而使不同羧基末端的释放速度趋于相近。因而使不同羧基末端的释放速度趋于相近。反应反应 pH pH 也影响释放速度。也影响释放速度。当当pHpH低至足以抑制羧基上低至足以抑制羧基上的正电荷时，释放速度加强。此外有可能以稳定的正电荷时，释放速度加强。此外有可能以稳定的活性形式固定化羧肽酶，这可显著提高的活性形式固定化羧肽酶

54、，这可显著提高 C C 端端测定的利用率。目前至少有测定的利用率。目前至少有 4 4 种不同的羧肽酶种不同的羧肽酶可供利用。下表列出了这些酶的来源，反应条件可供利用。下表列出了这些酶的来源，反应条件及专一性。及专一性。表表 四种羧肽酶的性质及其降解条件四种羧肽酶的性质及其降解条件第四节第四节 肽链的专一性水解和肽片断的分离纯化肽链的专一性水解和肽片断的分离纯化 一、一、肽链的专一性水解肽链的专一性水解 （一）蛋白质的化学裂解（一）蛋白质的化学裂解 1. 溴化氰裂解溴化氰裂解 2. BNPSSkatole法法 3. 亚碘酰基苯甲酸裂解法亚碘酰基苯甲酸裂解法 4. XCys键的裂解键的裂解 5.

55、羟胺裂解羟胺裂解 6. Asp Pro键的裂解键的裂解 （二）（二）蛋白质的酶法裂解蛋白质的酶法裂解 二、肽段的分高纯化及纯度鉴定二、肽段的分高纯化及纯度鉴定 （一）（一）肽段的分离纯化肽段的分离纯化 （二）肽段的纯度鉴定（二）肽段的纯度鉴定 MetMet X X Trp X X 2 -硝基硝基-5-5-硫氰苯甲酸硫氰苯甲酸（NTCBNTCB）和（）和（2-2-甲基）甲基）-N-N-l-l-苯磺酰苯磺酰-N-4-N-4-（溴乙酰）（溴乙酰）醌二亚酰胺（醌二亚酰胺（CyssorCyssor ）AsnGlyGly 酸，酸，羟胺羟胺pH2.5pH2.5 一个标准：纯肽只有一个标准：纯肽只有一个一个

56、N 端端一、肽链的专一性水解一、肽链的专一性水解裂解时有两个问题必须注意裂解时有两个问题必须注意一、要求裂解点少，专一性强、收率高一、要求裂解点少，专一性强、收率高二、与二硫键相关二、与二硫键相关方法基本上分两大类：方法基本上分两大类：一、化学法一、化学法二、酶法二、酶法回节目录（一）蛋白质的化学裂解（一）蛋白质的化学裂解 化学法裂解的肽段一般较大，适化学法裂解的肽段一般较大，适于在自动序列分析仪中测定序列，同于在自动序列分析仪中测定序列，同时有利于肽段的吻合，所以化学法对时有利于肽段的吻合，所以化学法对较大分子量的蛋白质的序列测定是很较大分子量的蛋白质的序列测定是很重要的。下面介绍最常用的化

57、学裂解重要的。下面介绍最常用的化学裂解法法。 l溴化氰裂解溴化氰裂解 溴化氰能专一裂解蛋氨酸残基的溴化氰能专一裂解蛋氨酸残基的羧端肽键羧端肽键，产率达到，产率达到85。溴化氰与。溴化氰与蛋白质中蛋氨酸侧链硫醚基反应，生蛋白质中蛋氨酸侧链硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，此产物与水进一步成溴化亚氨内酯，此产物与水进一步反应，将肽键断裂，反应如下图所示：反应，将肽键断裂，反应如下图所示： 溴化亚氨内酯溴化亚氨内酯 反应在酸性介质中进行。此时巯基也能反应在酸性介质中进行。此时巯基也能发生反应，但不切断肽链。若事先用烷基发生反应，但不切断肽链。若事先用烷基化试剂保护巯基，可防止此反应发生。化试剂保护巯基，

58、可防止此反应发生。注意：注意：Ser、Thr干扰；干扰； AspPro 蛋白质一般含蛋白质一般含 Met较少，所以溴化氰裂解蛋白质能得到大的肽段。较少，所以溴化氰裂解蛋白质能得到大的肽段。Met 如被氧化成砜或亚砜，则不能发生裂解反应，所以整个反应要如被氧化成砜或亚砜，则不能发生裂解反应，所以整个反应要在氮气容器中进行。溴化氰相对在氮气容器中进行。溴化氰相对Met要过量要过量 50100倍（摩尔比），倍（摩尔比），反应时间通常反应时间通常24小时。小时。2. BNPSSkatole法法 在酸性介质中，用溴化剂裂解多肽已经多年了。在酸性介质中，用溴化剂裂解多肽已经多年了。例如，例如，N 溴琥珀酰

59、亚胺（溴琥珀酰亚胺（NBS）可在不同部位裂解可在不同部位裂解多肽，包括多肽，包括Trp、Tyr、His等部位，但常有副反应，产等部位，但常有副反应，产生不溶物。生不溶物。BNPSskatole是一种温和的氧化剂和溴化是一种温和的氧化剂和溴化剂。剂。该试剂对该试剂对Trp裂解的专一性比裂解的专一性比NBS高，产率通常在高，产率通常在5070，缺点是试剂不太稳定，对光敏感，所以反，缺点是试剂不太稳定，对光敏感，所以反应要在暗处进行。它可应要在暗处进行。它可在在Trp残基的残基的 羧基一侧裂解肽羧基一侧裂解肽键键。蛋白质中一般含。蛋白质中一般含Trp极少，所以这是一个很有用的极少，所以这是一个很有用

60、的裂解方法。裂解方法。Met和和Tyr也能与该试剂作用，但也能与该试剂作用，但Met在反在反应结束后可用还原剂（巯基乙醇）再生，而与应结束后可用还原剂（巯基乙醇）再生，而与Tyr的反的反应可用加入过量应可用加入过量Tyr来避免。来避免。 BNPSskatole的结构式的结构式返回3. 亚碘酰基苯甲酸裂解法亚碘酰基苯甲酸裂解法此试剂可在相当温和条件下此试剂可在相当温和条件下裂解裂解 Trp X 肽键肽键，产率可达，产率可达70100。反应机理是氧化吲。反应机理是氧化吲哚环。哚环。蛋白质溶在蛋白质溶在 4 molL盐酸胍（用盐酸胍（用 80醋酸醋酸液配制）中，再加甲酚并与该试剂于室温暗处反液配制）