Myc基因通过调节PDL-1的表达促进DLBCL增殖的机制研究-博士科研计划书

1、考试方式：公开招考本科直博口硕博连读报名号：博士科研计划书学生姓名：报考院系：报考专业：研究方向：导师：年月日一、立题依据产重点介绍本项目的科学意义、国内外现状，弁附主要参考文献【研究意义】弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma,DLBCL足非霍奇金淋巴瘤(NHL)最常见的组织学类型1,占成人淋巴瘤的30%40%。我国24个中心联合收集了10002例病例，统计结果显示，中国的DLBC占NHL45.8%,所有淋巴瘤的40.1%2。研究表明肺癌最主要的致病原因与病毒感染以及化学毒物等环境致癌物相关，分子流行病学研究发现EBW毒、化学物或紫外线等可作为启动因子参与改

2、变多个与DNA复制及修复相关的传导通路，引起细胞的遗传学改变进而致癌。例如癌基因如BCL-6激活，从而引起生发中心细胞增殖异常及凋亡障碍，最终导致B细胞生长调节失控而形成月中瘤。目前环境污染致癌已成为全民关注的热点问题，因此探寻与环境致癌物相关的新调控因子并阐明其作用机制是当前月中瘤防治工作中十分迫切的科学议题。研究发现，发生c-Myc重排的弥漫大B细胞淋巴瘤患者具有Ki67高表达的特点3,提示该基因重排与淋巴瘤细胞的无限增值有关。文献报道大约有8%-25%JDLBC患者存在c-myc基因重排4-6,且为DLBC思者的一个不良预后因素。止匕外，大约24%勺弥漫大B细胞淋巴瘤患者不同程度地表达P

3、DL1在动物,K型中，MycS因可促进PDL-1的表达，从而抑制机体免疫功能，并促进月中瘤生长，而抑制MycS因可下调PDL-1的表达水平，增强抗月中瘤免疫反应，最终抑制月中瘤生长口。这些研究数据为进一步研究弥漫大B细胞淋巴瘤的发生发展机制和靶向治疗提供了新思路。在以往研究的基础上，本课题将研究mycS因在弓漫大虔田胞淋巴瘤发生中的作用，并在细胞水平和在动物模型中揭示my&口何通过调控PDL-1表达促进DLBC增殖的分子机制。本研究的意义在于：1.阐明myc#因对PDL-1表达的调控机制，揭示mycS因在弓漫大B细胞淋巴瘤中的作用机制；3.证实mycS因促进PDL-1表达是弥漫大B细胞

4、淋巴瘤发生发展中的关键分子生物学事件，并促进弥漫大B细胞淋巴瘤的增殖；4.阐明干扰RNAtB细胞淋巴瘤中内源性mycS因的抑制作用，进而促进月中瘤细胞凋亡的机制；5.以上科学问题的阐明将为弥漫大B细胞淋巴瘤的预防和靶向治疗提供有价值的理论基础和试验依据。【国内外研究现状及发展动态分析】DLBCL子发于中老年男性，发病年龄范围广，平均发病年龄70岁，亦可见于儿童，主要临床表现为无痛性淋巴结月中大伴潮热、盗汗等全身症状，也可累及结外组织，常见于胃肠道、中枢等受侵。根据基因表达特征可将DLBC吩成2种亚型：一种为生发中心B细胞样(germinalcenterBcell-like,GCB)另一种为非生

5、发中心Bffl月样(non-GCB),又称活化隹田胞样(activatedB-cell1ike,ABC)8。DLBC是高度侵袭性恶性月中瘤，一旦诊断，应及早治疗，采取积极的联合化疗，约50%的患者可以获得临床治愈。利妥昔单克隆抗体(Rituximab，商品名：美罗华)的问世，美罗华联合化疗的R-CHOP案应运而生，使得DLBCL患者5年生存率(overallsurvival,OS)W所提高。但是仍有不少患者在治疗结束后复发甚至在治疗过程中进展，亟待研究发现新的治疗靶点，进一步弥漫大B细胞淋巴瘤的治疗效果。c-myc基因是定位于染色体8q24的一种癌基因，myc#因及其产物mycg白具有促进DN

6、A复制以及调节G,细胞周期分布、细胞生长、细胞增殖及分化等功能9。在恶性淋巴瘤、白血病及各种上皮细胞来源的恶性月中瘤组织中均有mycS因及蛋白的过度表达，mycS因的扩增或其蛋白的过度表达可促进月中瘤细胞生长。文献报道大约有8%-25%JDLBC患者存在c-myc基因重排4-6,且为DLBC患者的一个不良预后因素。特异性效应T细胞的成熟需要两个信号，一是抗原呈递细胞呈递的抗原肽与T细胞表面受体TCR-CD3合体交连，产生的抗原特异性TCRS号；二是由APCfe面分子与T细胞表面相应受体结合所提供的第二刺激信号，即共刺激信号，该信号是非抗原特异性的，能够决定受抗原刺激的T细胞是增殖、分化成为效应

7、细胞，还是进入无反应状态或凋亡。PD混从发生程序性死亡的T细胞中分离出来的一种跨膜蛋白，是CD2琼族成员之一，主要表达于T细胞、B细胞和骨髓细胞表面。PD混负向调节共刺激分子，是诱导效应T细胞进入静息凋亡的表面标志，它通过免疫受体酪氨酸转换基序的酪氨酸磷酸化来募集酪氨酸磷酸酶2,传递负性刺激信号，能有效抑制早期激活的T细胞及其抗原受体信号10。PDLfl"1999年被确认为PD-1的配体(也叫B7-H1),PDL-1的mRNA泛分布于心脏、骨骼肌、肺、脾脏、肾脏、肝脏等非淋巴组织。但PD-L1蛋白表达主要是限于巨噬细胞来源的细胞，如肝库弗细胞、血管内皮细胞等。PD1/PD-L1B号传

8、导系统属于第二共刺激信号，传递负性调控信号。PDL1与PD给合后，能抑制T细胞增殖和细胞因子的分泌，在T细胞激活和分化的不同阶段中，该信号途径的共刺激和共抑制角色与慢性感染性疾病，自身免疫性疾病和月中瘤等密切相关，PD1/PDL-1信号的抑制原理并非直接引起T细胞凋亡，而是使T细胞发育停滞于G0/G1W,该期的细胞处于静息状态，不能实现T细胞的毒性吞噬功能11。研究表明，PDL促影响多种实体瘤患者生存的一个不良预后因素，但PDL-1在淋巴增生性疾病中的预后作用不一。研究表明，PDL俵达于约24%勺弥漫大B细胞淋巴瘤患者12。近年来的研究表明，一些小的双链RN版为干扰RNA(RNAinterfe

9、rence,RNAi),它可以高效、特异地降解有关基因的mRNA诱使RNA0胞表现出特定基因缺失的表型13。目前，RNA技术已成为探寻与月中瘤相关基因和研究功能基因组学领域的一个重要研究方向及热点。有研究发现，21bp、干扰性(smallinterferenceRNA,siRNA)可在体外培养的哺乳类细胞中特异性抑制内源和外源基因的表达14o将siRNA装入表达载体，使其在细胞内表达发火RNA(hRNA成为shRNAFire等首次发现了双链RNAt够导致基因沉默的现象来源于对线虫caenorhabditiselegans的研究15。在小鼠和人的体外培养细胞中，利用RNA技术可成功地阻断基因的表

10、达，实现了细胞水平的基因敲除16。国内许杨等17研究表明，干扰RNA9显著抑制肝癌细胞内源性c-myc基因的表达。因此，采用RNA干扰技术，抑制具有mycS因重排的DLBCL中瘤细胞中的mycS因表达可能会取得较好的效果。Myc基因作为一种原癌基因，通过调节RUNX3CD47PDL1等分子的表达在多种月中瘤的发展中起到重要作用。本课题旨在研究myc基因重排、PDL1在DLBCL患者中的表达情况，探讨myc基因可通过调节PDL-1的表达进而促进DLBCL增殖，并影响荷瘤小鼠存活时间，使用干扰RNA可抑制DLBCL细胞myc基因，从而为治疗DLBCL潜在的靶向药物参考文献：1 .Sabattini

11、E,BacciF,SagramosoC,eta1.WHOclassificationoftumoursofhaematopoieticandlymphoidtissuesin2008:anoverviewJ.Pathologica,2010,102(3)83-87.2 .朱雄增，李小秋.解读2008年恶性淋巴瘤WHO类-霍奇金淋巴瘤及其它J.临床与identifiedbygeneexpressionprofilingJ.Nature,2000,403(6769):503-5.7.8.实验病理学杂志，2010(5):515-517.SavageKJ,JohnsonNA,Ben-

12、NeriahS.eta1.MYCgenerearrangementsareassociatedwitapoorprognosisindiffuselargeB-celllymphomapatientstreatedwithR-CHOPchemotherapyJ.Blood,2009,114(17):3533-3537.YoonSO,JeonYK,PaikJH,eta1.MYCtranslocationandanincreasedcopynumberpredictpoorprognosisinadultdiffuselargeB-celllymphoma(DLBCL),especiallying

13、erminalcentre-likeBcell(GCB)typeJ.Histopathology,2008,53(2)：205-217.王志林等，弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫表型分类与c-MYCt排的相关性研究，检验医学，2013年4月第28卷第四期，308-311oKarenM.Chisholm,etal.ExpressionProfilesofMYCProteinandMYCGeneRearrangementinLymphomas.AmJSurgPathol2015.CaseySC,TongL,LiYL,etal.MYCregulatestheantitumorimmuneresponseth

14、roughCD47andPD-L1.Science.2016.AlizadehAA,EisenMB,DavisRE,eta1.DistincttypesofdiffuselargeBcelllymphoma9. AuWY,HorsmanDE,GascoyneRD,eta1.Thespectrumoflymphomawith8q24aberrations：aclinical,pathologicalandcytogeneticstudyof87consecutivecasesJLeukLymphoma,2004,45(3):519-528.10. OkazakiT,MaedaA,Nishimur

15、aH.eta1.PD-1immunoreceptorinhibitsBcellreceptor-mediatedsignalingbyrecruiting8rchomology2-domain-containingtyrosinephosphatase2tophosphotyrosineProcAeadSciUSA.2001,98:13866-13871.11. ZhangX,SchwartzJC,GuoX,etalStructuralandfunctionalanalysis0ftheeostimulatoryreceptorprogrammeddeath1.Immunity。2004,20

16、:337.347.12. AndorskyDJ.YamadaRSaidIW,eta1.Programmeddeathligand1(PD-L1)isexpressedbynon-hodgkinlymphomasandinhibitstheactivityoftumorassociatedtcellsClinCancerRes,2011;17(13):4232-4244.13. BernsteinE,CaudyAA,HammondSM,etal.RoleforabidentateribonucleaseintheinitialstepRNAinterference.Nature.2001.409

17、:363-366.14. TiscorniaG,SingerO,IkawaM,etal.AgeneralmethodforgeneknockdowninmicebyusinglentiviralvectorsexpressingsmallinterferingRNA.ProcNatAcadsci,USA,2003,100:1844-1848;15. Fire,etal,potentandspecificgeneticinterferencebydoublestrandedRNAinCaenorhabditis.Nature,1999.391,806-811.16. GarmellMA,Zhan

18、gL,ConklinDS,etal.GerminetransmissionofRNAiinmice.NatStructBiol.2003.10:91-92.17. 许杨等，干扰RNA对HepG2肝癌细胞内源性myc表达的抑制作用。中华月中瘤杂志；2004年8月第26卷第8期。二、研究内容产研究目标、研究内容、创新之处和拟解决的关键问题【研究内容】一、DLBCL组织中myc基因和PDL-1表达的进一步验证及与预后的关系；国内外相关研究已经提示myc基因及PDL-1在一定比例的DLBCL患者癌组织中存在不同程度地表达，和DLBCL的发生相关，为了进一步验证推测，可收集大约200例的样本，并评估my

19、c基因和PDL-1表达与患者治疗疗效、生存时间的关系。1、DLBCL组织标中检测myc基因和PDL-1表达，从本院病理科获取200例DLBCL标本（包含随访资料），通过免疫组织化学及FISH检测等方法，检测DLBCL组织和癌旁组织中myc和PDL-1在mRNA和蛋白水平的表达，评估肿瘤组织和癌旁组织中myc和PDL-1表达的差异。并将上述指标在50例新鲜DLBCL患者癌组织标本中进一步验证。2、根据1中的检测分析，获得myc和PDL-1在DLBCL患者的表达情况，通过前瞻性研究、回顾性研究等手段分析患者肿瘤组织和血浆中分析两者与患者治疗疗效的关系，评价myc和PDL-1与患者生存时间的相关性。

20、二、Myc可调节PDL-1的表达，并最终促进DLBCL细胞增殖的机制研究；在第一部分中明确了DLBCL中一部分患者存在myc基因阳性，PDL-1高表达，且myc基因阳性及PDL-1高表达与DLBCL的预后相关，接下来在细胞实验中验证myc调节PDL-1表达并促进DLBCL细胞增殖的作用。1、通过Lipofectamine2000脂质体将myc基因转染至人B细胞淋巴瘤细胞株中，检测转染效率，并设置空白对照组、阴性对照组和myc转染组三组，使用MTTffl胞增殖实验检测细胞增殖情况，Transwell法检测细胞迁移能力，划痕实验测细胞的迁移距离，流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率，RT-PCRt检

21、测PDL1mRN照录水平,Westernblot法检测蛋白的表达水平。2、将一部分myc基因阳性的细胞株分为三组，第一组进行培养后直接检测PDL1mRN及PDL1蛋白含量；第二组加入JQ1进行培养后检测PDL1mRN版PDL1蛋白含量；第三组在第三部分详述。三、干扰RNA对B细胞淋巴瘤细胞内源性c-myc表达的抑制作用研究；上述两部分已经明确了myc基因阳性及PDL-1高表达与DLBCL的预后相关，且myc可通过调节PDL-1在RNA及蛋白水平的表达，接下来在细胞实验中研究干扰RNA是否可抑制c-myc基因的表达。1、质粒：含c-myc的一段特异序列的Psilencer-c-myc载体，由中国

22、医学科学院肿瘤研究所细胞生物室构建并提供。Psilencer-c-myc表达载体5'端为特定的RNA聚合酶III启动子（U6）,中间为shRNA对应的序列，3'端为聚合酶的转录终止序列。此Psilencer-c-myc表达载体可在细胞内表达shRNA。2、转染：B细胞淋巴瘤细胞采用脂质体进行转染。实验组加入Psilencer-c-myc,对照组加入Psilencer3天后收集细胞，提取RNA、蛋白进行检测。3、定量PCR:用trizol提取实验组与对照组细胞中的总RNA。定量RNA和cDNA,并分别加入30ngcDNA扩增c-myc、histone基因。4、Westernblo

23、t及图像分析：Psilencer-c-myc转染B细胞淋巴瘤细胞3天后收集细胞，加入细胞裂解液，Westernblot法对myc蛋白进行检测，运用BIO-RAD公司的Quatitiveone4.4.1软件对Westernblot结果进行分析。5.细胞周期和凋亡细胞分析：收集转染后第3天的细胞，进行PI染色，经流式细胞仪测定细胞周期和凋亡细胞。采用PrapoptoticKit中的AnexinV标记早期凋亡细胞，DAPI着染细胞核，荧光显微镜进行检测并照相。四、myc表达对DLBCL细胞增殖及荷瘤小鼠存活时间的影响；通过上述二部分研究，明确了myc可通过调节PDL1的表达进而促进DLBCL细胞增殖

24、的分子生物学机制，接下来要进一步研究该通路对DLBCL的细胞生物学功能及荷瘤小鼠存活时间的影响，为将myc作为潜在疗效判断指标提供理论依据。1、通过Lipofectamine2000脂质体将myc基因转染至人B细胞淋巴瘤细胞株中，检测转染效率，并设置阴性对照组和myc转染组两组，检测PDL1mRN股PDL1蛋白含量，2、使用上述两种细胞系制作裸鼠荷瘤槿型.分别观察两组小鼠的总牛存时间.研究myc表送与荷嘱小鼠存活时间的关系；3、取出2中的裸鼠荷瘤，使用免疫组化检测检测PDL-1表达的改变。通过以上研究，明确myc通过上调PDL-1表达促进DLBCL细胞增殖的机制研究表达对DLBCL治疗的作用以

25、及阐明其影响肿瘤生物学行为的分子生物学机制，为DLBCL的个体化治疗提供新的药物靶点和理论基础。【研究目标】(1)明确myc基因是DLBCL发生的重要原因。(2)证明myc能够通过上调PDL-1表达促进DLBCL细胞增殖；为DLBCL的临床诊治特别是靶向治疗提供理论基础和实验依据。(3)证明干扰RNA对B细胞淋巴瘤细胞内源性c-myc表达有抑制作用，从而为治疗提供理论依据。【拟解决的关键科学问题】(1) myc在DLBCL发生中的作用。(2) myc可通过调节PDL-1的表达进而促进DLBCL增殖，并影响荷瘤小鼠存活时间。(3) 使用干扰RNA可抑制DLBCL细胞myc基因，为治疗DLBCL潜

26、在的靶向药物。【创新之处】(1)首次明确myc基因可以促进DLBCL细胞增殖，其机制是促进PDL-1表达，抑制机体的抗肿瘤免疫反应，并最终促进DLBCL发生及增殖；(2)首次探讨干扰RNA在DLBCL中对抑制内源性myc基因的表达及对细胞增殖的影响，说明干扰RNA可作为肿瘤基因治疗的基本策略。、拟采取的研究方法、技术路线【研究方法】1、从病理科标本库中筛选DLBCL勺石蜡标本，通过免疫组织化学及FISH等方法检测myc基因与PDL-1表达水平；收集DLBC味后新鲜组织标本，将上述指标在新鲜月中瘤组织中进一步验证；其次，将已经收集的DLBCL患者新鲜组织标本，检测myc基因与PDL-1表达情况；最后，通过前瞻性研究、回顾卜t研究等手段分析患者月中瘤组织中myc基及PDL-1与患者治疗疗效的关系，评价myc基因与PDL-1表达水平及活性与患者生存时间的相关性。2、通过Lipofectamine2000脂质体将myc基因转染至人B细胞淋巴瘤细胞株中，检测转染效率，并设置空白对照组、阴性对照组和myc转染组