贝类微生物检验讲课教案

1、贝类微生物检验致病菌的危害致病菌的危害u细菌性微生物是人类食物链中最常见的病原，主要有大肠杆菌、沙门氏菌、结核菌、炭疽菌、肉毒梭菌、李斯特菌、葡萄球菌、猪链球菌、副溶血弧菌等。 食品感染食品感染通过活菌摄入引起人体（通常是肠道）感染 食物中毒食物中毒预先在食品中产生的细菌毒素导致人类中毒u李斯特菌对胎儿危害极大，2004年导致107例死亡（欧盟，2005）。u沙门氏菌对禽类、生猪及其鲜肉制品的感染率最高，蛋类、禽类肉制品和猪肉是人类感染沙门氏菌病的主要渠道（欧盟，2005）。u在夏秋季节的沿海地区，由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒时有发生。 食品卫生的监控重点是对微生

2、物污染的控制，只有从源头上切断食食品卫生的监控重点是对微生物污染的控制，只有从源头上切断食品污染的渠道，才能有效控制食品安全问题的发生。品污染的渠道，才能有效控制食品安全问题的发生。 贝类微生物检验的主要指标贝类微生物检验的主要指标u菌落总数u 大肠菌群u 沙门氏菌 副溶血性弧菌 单核细胞增生李斯特氏菌贝类微生物检验的样品处理贝类微生物检验的样品处理u采样部位为贝壳内容物。u先用流水刷洗贝壳，刷净后放在铺有灭菌毛巾的清洁的搪瓷盘或工作台上，采样者将双手洗净并用75%酒精棉球涂擦消毒后，用灭菌小钝刀从贝壳的张口处隙缝中徐徐切入，翘开壳盖，再用灭菌镊子取出整个内容物。u称取25g置灭菌乳钵内，用灭

3、菌剪子剪碎，加灭菌海砂或玻璃砂研磨（有条件情况下可用均质器），检样磨碎后进行进一步的检验。一、菌落总数测定一、菌落总数测定 l菌落（Bacterial colony）是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。l在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落(cfu)。 l菌落总数（菌落总数（Aerobic bacteria countAerobic bacteria count）是指在需氧情况下，37培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。l菌落总数也被称为杂菌数，需氧菌数等,并不表示实际中的所有细

4、菌总数,因厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温细菌，难以繁殖生长。l菌落总数测定是用于判定食品被细菌污染的程度及卫生状况判定食品被细菌污染的程度及卫生状况，它反映食品的生产过程是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。检验程序检验程序(GB/T 4789.2-2003)菌落总数检验操作及要求检验操作及要求采采 样样 不应集中一点，宜多采几个部位，样品必须经过均质或研磨，以保证取样均匀。稀稀 释释 l为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使 其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。l在进行连续稀释时，吸管插入检样稀释液内不得低于液面2.5cm，吸取 液体时

5、应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于三角瓶或试管的内壁使吸管内液体调至所要求的刻度。l当用吸管将检样稀释液加至另一空白稀释液时，应将吸管内液体沿管壁小心流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内。l样品稀释液主要是灭菌蒸馏水、灭菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、0.1蛋白胨水，磷酸盐缓冲液、 0.1蛋白胨水有修复食品中受损伤的细菌细胞的作用，如对含盐量较高的食品（如虾油）可采灭菌蒸馏水稀释。菌落总数检验操作及要求检验操作及要求接接 种种l根据样品被污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平

6、皿内作空白对照。 l倾注用培养基应在46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易凝固，而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。l倾注培养基量约为12-20ml，一般以15ml较为适宜，平板过厚可能影响观察，太薄又易于干裂。l倾注时，应将有沉淀物的培基底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察结果。l为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，旋转时应加小心，不要使混合物溅到皿边的上方。l检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌死亡或繁殖。菌落总数检验操作及要求检验操作及要求培培 养养l琼脂凝固后

7、应在数分钟内翻转并移至培养箱内培养，这样可避免菌落蔓延生长。必要时，可先将平皿打开倒置（皿底向上）于培养箱内，经15-60min使琼脂表面干燥后，再将皿底移至盖内倒置培养，可防止运动型强的变形杆菌属、假单胞菌属等在琼脂表面扩展生长。l培养温度一般为37（由于鲜冻水产品的生活环境水温较低，故多采用30的培养温度），培养时间一般为48h，当培养于24h时也就观察生长状况。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15。菌落总数检验操作及要求检验操作及要求菌落计数菌落计数l到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板暂时放置于0-4，但不得超过24h。l计数时可用肉

8、眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。 l计数时应选取菌落数在30-300之间的平板，若有二个稀释度均在30-300之间时，应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则取较小数字。 l若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30-300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之如所有稀释度均无菌落生长，则应

9、按小于1乘以最低稀释倍数报告之有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告 菌落总数检验操作及要求检验操作及要求菌落计数菌落计数l不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数报告的依据。 l当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。l如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半

10、个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 l当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 菌落总数二、大肠菌群测定 l大肠菌群（Coliform bacteria）并非细菌学分类命名，指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在需氧及兼性厌氧、在3737能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌属、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 l大肠菌

11、群是评价食品卫生质量的重要指标之一评价食品卫生质量的重要指标之一，该菌群主要来源于人及温血动物粪便，食品中大肠菌群的存在被认为是可能被粪便污染，从而推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。检验程序检验程序(GB/T4789.3-2003)大肠菌群大肠菌群乳糖发酵乳糖发酵分离培养分离培养证实试验证实试验检验操作及要求检验操作及要求乳糖发酵试验乳糖发酵试验l乳糖发酵试验是样品发酵的结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过平板分离和证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符

12、合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。l在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵物有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。 大肠菌群大肠菌群检验操作及要求检验操作及要求分离培养分离培养l初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。l由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板上大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠杆菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。

13、l在该伊红美蓝平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色 菌落检出率较低。l如平板上出现较多典型大肠菌群菌落， 革兰氏染色为阴性杆菌，即可做出判定。 如平板上典型菌落甚少或均不够典型， 应多选择菌落做证实试验。大肠菌群大肠菌群检验操作及要求检验操作及要求l最大可能数（最大可能数（MPNMPN）是表示样品中活菌密度的估测。MPN法是采用三个稀释度九管法，稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测，较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性，最高稀释度3管为阴性。如果无法估测样品中的菌数，则应做一定范围的稀释度。 大肠菌群大肠菌群三、沙门氏菌检验三、沙门氏菌检验

14、l沙门氏菌（Salmonella）广泛分布于自然界中，在人和动物中有广泛的寄主，能引起人类的伤寒、副伤寒和食物中毒等疾病，并引起动物的沙门氏菌病，是重要的肠道致病菌。沙门氏菌是一大群血清学上相类似的革兰氏阴性无芽胞杆菌，种类繁多，至1983年底已有2104个菌型。l沙门氏菌的分布极广，主要居于哺乳类、鸟类、两栖类和爬行类的肠道内以及被人或动物粪便污染的环境中，生肉和家禽常被这类菌污染，其感染率取决于物种、生产和加工过程以及从事于饮食服务行业的服务人员特别是炊事人员的带菌，可以造成食品污染而引起人类沙门氏菌感染导致食物中毒的发生。 l贝类由于生活水域被污染感染沙门氏菌污染。海产品中的沙门氏菌一般

15、比其他食品少得多。在各国报道的感染沙门氏菌事件总数中，鱼和贝类受感染的情况只占很少一部分，但是也不容忽视。生物学特性生物学特性l革兰氏阴性较为细长的杆菌，大小0.4-0.91-3m，无芽孢，一般有鞭毛，无荚膜，多数有菌毛。需氧或兼性厌氧菌。l一般在普通琼脂平板上生长良好，形成中等大小、半透明的s型菌落。在肠道杆菌选择性培养基上形成无色菌落。l生长温度范围为5-46，最适生长温度为35-37。最适生长pH为6.8-7.8。l100时立即死亡，70经5min或65经15-20min、60经1h方可被杀死。水经氯化物处理5min可杀死其中的沙门氏菌。沙门氏菌沙门氏菌检验程序检验程序(GB/T4789

16、.4-2003) 沙门氏菌沙门氏菌检验操作及要求检验操作及要求前增菌前增菌 细菌受冷冻、加热、干燥、高渗、酸碱、辐射等的影响，可致亚致死性的损伤，如给予适当的营养和温度很快即能恢复到稳定的生理状态，故经过冷冻或加工的食品，一般要先经过非选择性的前增菌。用于前增菌的培养基为缓冲蛋白胨水和乳糖肉汤，两种培养基的效果无显著差异。选择性增菌选择性增菌 未经加工的生食品或污染严重的食品，直接使用选择性增菌。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。选择性增菌培养基目前以亚硒酸盐胱氨酸增菌液、四硫磺酸盐煌绿增菌液和氯化镁孔雀绿增菌液为好。沙门氏菌沙门氏菌检验操作及要求检验操作及要求分离培

17、养分离培养 分离培养基通常用选择性培养基亚硫酸铋（BS）琼脂和鉴别性培养基胆硫乳（DHL）琼脂，此外还可用HE琼脂、WS琼脂和SS琼脂，分离效果依次递减。生化反应生化反应 沙门氏菌检验必要的生化项目只有五项，即三糖铁、靛基质、pH7.2尿素酶、KCN和赖氨酸脱羧酶。对于H2S阳性的细菌，足以正确鉴别沙门氏菌属和柠檬酸杆菌属，对于H2S阴性的细菌，查表到B1时，只要补做ONPG试验，即可正确鉴别沙门氏菌属和埃希氏菌属。沙门氏菌沙门氏菌DHL沙门氏菌沙门氏菌BS 菌落黑色有金属光泽 菌落周围培养基呈黑色 菌落无色半透明 菌落中心带黑色沙门氏菌沙门氏菌WSSS 菌落蓝绿色 菌落中心带黑色 菌落无色半

18、透明 菌落中心带黑色三糖铁琼脂斜面三糖铁琼脂斜面l斜面不变（乳糖蔗糖不分解)l底层变黄（葡萄糖产酸）l产（或不产）气l产H2S检验操作及要求检验操作及要求血清学反应血清学反应l检查O抗原将一滴O多价血清置于载玻片上，以接种环取少量三糖铁琼脂斜面的新鲜菌苔与之充分混合,将载玻片前后倾斜十几秒钟，肉眼判断结果30秒内呈现凝集反应的为阳性,一分钟以后出现的迟缓反应为阴性以生理盐水做对照，确定不是自然凝集l检查Vi抗原（方法同上）沙门氏菌沙门氏菌四、副溶血性弧菌四、副溶血性弧菌l副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为

19、海产食品引海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一起急性胃肠炎的重要病原菌之一。l我国沿海水域、海产品中副溶血弧菌检出率很高。据调查，华东地区沿岸海水的副溶血弧菌检出率为57.4%-66.5%，海产鱼虾的平均检出率为45.6%-48.7%，夏季可高达90%以上；该地区夏秋季淡水鱼虾检出率为50%-69.5%。l在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。生物学特性生物学特性 l不产芽孢、革兰氏阴性多形态杆菌，有单端鞭毛一根，运动活泼，常呈杆状、棒状、弧状、丝状等各种形态。大小约为（0.3-0.7）

20、m（1-2）m，丝状菌体长度可达15m。需氧性很强，厌氧条件下生长缓慢，营养要求不高。 l在固体培养基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊不透明，表面光滑，湿润，不产生色素。在比较新鲜湿润或软琼脂培养基上，有些菌株可形成不规则菌落或片状扩散生长，在0.7以上琼脂的培养基上能生长周鞭毛（侧毛）。一般在20-25培养生长的周鞭毛较为稳定，而在37培养或24h以上的培养物，周鞭毛易于由菌体自发脱落，具有周鞭毛的菌株，在固体培养基上多表现扩散生长，单鞭毛的菌株在固体培养基上呈典型菌落，不表现扩散生长。l本菌为嗜盐菌，生长发育须有NaCl存在，能够生长的培养基的NaCl浓度范围为0.5%-8%，在2%-3%时

21、生长最为旺盛。生长最适温度为30-37，42也能生长，10以下不能生长。最适pH为8.0，可以生长的pH范围为5.6-9.6。l不耐热，75加热5min或90加热1min，即可被杀死。该菌对醋酸敏感，1醋酸处理1min即可被杀死。副溶血性弧菌副溶血性弧菌检验程序检验程序(GB/T4789.7-2003)副溶血性弧菌副溶血性弧菌检验操作及要求检验操作及要求样品处理样品处理 副溶血弧菌不适于低温生存，在低温情况下容易死亡，因此，待检样品不要冷冻，以免影响检验结果。分离培养分离培养l首先将样品可直接接种NaCl蔗糖琼脂平板和选择性琼脂平板，同时接种增菌液，培育后再分离上述平板。l市场海产品一般应进行

22、增菌培养，增菌可用3%盐胨水或3%盐肉汤或其他抑制肠道菌的增菌培养基。l副溶血弧菌不分解蔗糖，因此在NaCl蔗糖琼脂平板上呈蓝色菌落。l推荐：TCBSTCBS琼脂琼脂作为分离培养基，因为有些弧菌例如溶藻胶弧菌具有泳动性，容易形成扩散生长而掩盖其他细菌的存在不易分离，所以应配合使用具有抑制性较强的培养基，如TCBS琼脂可抑制扩散生长，能出现单个菌落，同时也可抑制其他革兰氏阳性细菌生长。 副溶血性弧菌副溶血性弧菌l选择性培养基嗜盐菌选择性琼脂平板嗜盐菌选择性琼脂平板氯化钠蔗糖琼脂平板氯化钠蔗糖琼脂平板TCBS平板平板副溶血性弧菌副溶血性弧菌检验操作及要求检验操作及要求生化鉴定生化鉴定l从选择性平板

23、上挑选可疑菌落，接种于含有3.5NaCl的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，以防漏检。l挑取的细菌接种在三糖铁琼脂斜面上培养后，凡反应为乳糖、蔗糖不分解，葡萄糖产酸不产气、不产H2S，有动力者可作革兰氏染色镜检。如为革兰氏阴性，无芽孢，多形态、两端浓染，即可观察其嗜盐性；凡在无盐及10%盐胨水中不生长，在3-8%盐胨水中生长良好者可继续进行各项有关生化试验。l需要注意的是氨基酸水解酶反应液应加液体石蜡，否则由于与空气接触氧化会导致阴性结果转为阳性。l有可能时检查有无发光性。因为发光菌属有些种的细菌与副溶血弧菌类似，可能引起误诊，可在37培养过夜后，于暗处或紫外光下观察菌落，副溶血弧菌不发

24、光，可以与其鉴别。 副溶血性弧菌副溶血性弧菌氯化钠三糖铁琼脂氯化钠三糖铁琼脂 斜面不变（乳糖蔗糖不分解） 底层变黄（葡萄糖产酸） 不产气 不产H2S副溶血性弧菌副溶血性弧菌检验操作及要求检验操作及要求动物试验动物试验l经生化检验判定为可疑的菌株，用小鼠测定毒力，将16-18h的蛋白胨水或肉汤培养物，注射小鼠腹腔0.3mL，有毒力者可在5-10h发病死亡，长者有24h左右发病死亡。发病时有竖毛、运动不活泼，腹部紧贴罐底，呼吸困难，四肢抽搐、尾部痉挛震颤等症状。将死亡小鼠解剖后，取心血等内脏进行分离，可检出试验菌的纯培养。对照动物观察2-3d无异常现象。l注意，有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有时

25、不易区别，需要上述检验后，进行毒力证实，综合判定结果。 副溶血性弧菌副溶血性弧菌五、单核细胞增生李斯特氏菌检验 李斯特氏菌属（Listeria）普遍存在于环境中，在很多食品中都能 检出李斯特菌。目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株：u单核细胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）u绵羊李斯特氏菌（L.ivanovii）u英诺克李斯特氏菌（L.innocua）u威尔斯李斯特氏菌（L.welshimeri） u西尔李斯特氏菌（L.seeligeri）u格氏李斯特氏菌（L.grayi）u默氏李斯特氏菌（L.murrayi） 其中只有单核细胞增生李斯特氏菌能引起人类疾病、是一种人畜共患病原菌

26、，能引起人类的李斯特氏菌症（listeriosis），感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。 食品中存在单增李斯特菌对人类的安全有潜在的危险，该菌在4的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 生物学特性生物学特性l革兰氏阳性短杆菌，大小约（0.4-0.5）m（0.5-2）m，多数菌体一端较大，似棒状，常呈V字型排列，有时呈丝状或短链状。在22-25环境可形成4根鞭毛，故在25幼龄肉汤培养基中运动活泼，在32下仅有一根鞭毛，动力缓慢。在血清葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜，无芽孢。幼龄培养物呈革兰氏阳性，48h呈革兰氏阴性

27、。l兼性厌氧，营养要求不高，在含有肝浸汁、腹水、血液或葡萄糖的培养基中生长更好。菌落初期极小，水滴样，37培养数天后，直径可达2mm。菌落初期光滑、透明，后期变为灰暗。血平板上的菌落有-型溶血环。l耐碱不耐酸，在pH 5.0-9.0范围内均能生长，在pH 9.6中仍能生长，但在pH 5.6时仅可生长2-3d。该菌在2-42均能生长，最适生长温度为30-37。 单增李斯特菌单增李斯特菌检验程序检验程序(GB/T4789.30-2003)单增李斯特菌单增李斯特菌检验操作及要求检验操作及要求增菌培养增菌培养l取回的样品应在4下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。样品用一次增菌

28、法（EB增菌液）和二次增菌法（LB1、LB2增菌液）进行增菌培养，30培养48h。单增李斯特菌单增李斯特菌检验操作及要求检验操作及要求分离培养分离培养l培养后，取EB和LB2培养物分别在MMA琼脂平板上划线，置于30培养48h。用白炽灯照射平板，检查平板上的可疑菌落，光线和平皿底要明显呈45角。李斯特氏菌在MMA平板上呈现灰蓝或蓝色灰蓝或蓝色。用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。单增李斯特菌单增李斯特菌l 推荐：OXAOXA或或PALCAMPALCAM琼脂平板琼脂平板，李斯特氏菌在OXA平板上生长24h菌落呈黑色，周围形成一黑色环，直径约1mm，培养48h，菌落仍呈黑色，直径23mm，除在菌

29、落周围有一环，菌落中心部位的深层也形成黑点。三糖铁琼脂 斜面变黄（乳糖蔗糖分解） 底层变黄（葡萄糖产酸） 不产气 不产H2S半固体动力培养基 有动力 呈伞状生长l从平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别接种三糖铁 琼脂斜面和SIM动力培养基，单增李斯特菌在三糖铁琼脂上层和下层产酸而不产H2S，在动力培养基中呈伞状或月牙状生长。将可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）进行纯培养，并做生化鉴定。单增李斯特菌单增李斯特菌检验操作及要求检验操作及要求生化鉴定生化鉴定l观察TSA-YE平板通过斜射光观察，寻找灰蓝或蓝色菌落。在TSA-YE上用已知菌作对照。l从30或更低温度下培养的TSA-Y

30、E平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观察。湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。如果菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。l挑取典型菌落进行过氧化氢酶实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性过氧化氢酶阳性反应。l取16-24h的培养物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性杆菌。但是陈旧培养物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。 单增李斯特菌单增李斯特菌检验操作及要求检

31、验操作及要求生化鉴定生化鉴定l在TSA-YE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血琼脂平板上，刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂，同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌），30培养48h。单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小的-溶血环溶血环。l将TSA-YE培养物分别进行硝酸盐还原试验，尿素酶试验，MR-VP试验和七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵试验，所有李斯特菌均不能分解尿素尿素，MR-VPMR-VP试验试验均为阳性，均能发酵七叶苷七叶苷，除格氏李斯特氏菌和默氏菌不能发酵甘露醇。因此在实际操作中需要区分李斯特菌种时，可以选择其中几项有差异的生化反应进行判定

32、。 单增李斯特菌单增李斯特菌检验操作及要求检验操作及要求小鼠毒力试验小鼠毒力试验l将分离的菌株接种到10 mL TSB-YE肉汤中，30培养24h，将培养物离心、浓缩，用1mL生理盐水制成菌悬液（浓度为1010/mL），取0.1mL腹腔注射体重为16-18g 小鼠，每组5只，观察7d内小鼠死亡情况。l用已知致病的单增李斯特氏菌和非致病的英诺克李斯特氏菌相同方法进行，做对照试验。协同溶血试验协同溶血试验l在羊血琼脂平板上平行接种-溶血金黄色葡萄球菌和马红球菌，在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30培养24h-48h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。l靠近金黄色葡萄球菌接种点

33、的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红球菌附近的溶血增强。单增李斯特菌单增李斯特菌 APIVitek GNIVidas显色培养基显色培养基沙门氏菌（亮红色）副溶血性弧菌（蓝色）单增李斯特氏菌（蓝色，周围有透明圈）沙门氏菌国内外检验方法沙门氏菌国内外检验方法方法名称方法名称一次增菌一次增菌二次增菌二次增菌分离分离鉴定鉴定快速方法快速方法GB/T 4789.7-GB/T 4789.7-20032003未经加工未经加工BPWBPWTTBTTB（MMMM）、）、SCSCBSBS、DHLDHL（或（或HEHE、WSWS、SSSS）TSITSI（排除（排除A/A H2

34、SA/A H2S结果结果 ），靛基质，），靛基质，尿素，尿素，KCNKCN，赖氨酸，血清学，赖氨酸，血清学无无加工加工TTBTTB（MMMM）、）、SCSCSN 0173-1992SN 0173-1992未经加工未经加工BPWBPWTTBTTB、SCSCBSBS、DHLDHLTSITSI、靛基质，尿素，、靛基质，尿素，KCNKCN，赖氨酸等，赖氨酸等，血清学血清学无无加工加工TTBTTB、SCSCFDAFDA乳糖肉汤（乳糖肉汤（LBLB）、胰）、胰酪胨大豆肉汤（酪胨大豆肉汤（ TSBTSB）或或 煌绿溶液煌绿溶液 （BGBG）TTBTTB、RVRVBSBS、XLDXLD或或HEHETSITSI

35、、LIALIA、尿素酶，、尿素酶，H H抗原（多价抗原（多价H H抗血抗血清或清或Spicer-Edwards flagellar (H) Spicer-Edwards flagellar (H) testtest），赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉），赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（汤，色氨酸肉汤（KCNKCN，丙二酸盐，吲，丙二酸盐，吲哚），哚），O O抗原、酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖抗原、酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，肉汤，MR-VP,MR-VP,西蒙氏柠檬酸盐西蒙氏柠檬酸盐5 5种商业生化鉴定系种商业生化鉴定系统统（API 20E, API 20E, Enterotube II, Ent

36、erotube II, EnterobacteriaceaEnterobacteriaceae II,MICRO-IDe II,MICRO-ID或或 Vitek GNIVitek GNI）、）、O O抗抗原、原、H H抗原抗原USDAUSDABPWBPWTTBTTB、RVRVBGSBGS、DMLIADMLIA或或 XLT4XLT4TSITSI、LIALIA、葡萄糖、脲酶试验、卫矛醇、葡萄糖、脲酶试验、卫矛醇、动力试验、吲哚、动力试验、吲哚、MR-VPMR-VP测试、氰化钾、测试、氰化钾、粉红酒石酸盐琼脂、乳糖、水杨苷、赖粉红酒石酸盐琼脂、乳糖、水杨苷、赖氨酸脱羧酶、西蒙氏枸橼酸盐、丙二酸、氨酸

37、脱羧酶、西蒙氏枸橼酸盐、丙二酸、蔗糖、血清学试验蔗糖、血清学试验商业生化试剂盒或商业生化试剂盒或自动鉴定系统自动鉴定系统 AOACAOACSCSC、TTBTTBBSBS、XLDXLD或或HEHETSITSI、LIALIA、尿素酶、尿素酶、H H抗原，抗原，LIALIA，酚红，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤、卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤、KCNKCN，丙二酸，丙二酸盐，吲哚，盐，吲哚，O O抗原、酚红乳糖肉汤，酚红抗原、酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，蔗糖肉汤，MRMRVP,VP,西蒙氏柠檬酸盐西蒙氏柠檬酸盐无无ISOISOBPWBPW酚红煌绿琼脂（亮酚红煌绿琼脂（亮绿琼脂）、第二种绿琼脂）、第二种选择性平板

38、选择性平板TSITSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPGONPG，VPVP，吲哚、血清学试验吲哚、血清学试验O O抗原，抗原，ViVi抗原，抗原，H H抗原抗原无无副溶血性弧菌国内外检验方法副溶血性弧菌国内外检验方法方法名称方法名称一次增菌一次增菌二次增菌二次增菌分离分离鉴定鉴定快速方法快速方法GB/T 4789.7-GB/T 4789.7-20032003氯化钠结晶紫氯化钠结晶紫氯化钠蔗氯化钠蔗糖琼脂糖琼脂嗜盐菌选嗜盐菌选择性琼脂择性琼脂蓝绿色菌落，氯化钠三糖铁、革兰蓝绿色菌落，氯化钠三糖铁、革兰氏染色、盐胨水、甘露醇、甲基红、氏染色、盐胨水、甘露醇、甲基红、V-PV-P

39、、靛基质、赖氨酸、鸟氨酸、精、靛基质、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、氧化酶等氨酸、氧化酶等无无SN SN 0173鲜样新鲜样品品单料氯化钠多单料氯化钠多粘菌素粘菌素B B肉汤肉汤双料多粘菌素双料多粘菌素B B肉汤肉汤TCBSTCBS蓝绿色菌落，氯化钠三糖铁、革兰蓝绿色菌落，氯化钠三糖铁、革兰氏染色、盐胨水、氏染色、盐胨水、V-PV-P、靛基质、赖、靛基质、赖氨酸、精氨酸、动力、氨酸、精氨酸、动力、4242生长、生长、O/FO/F等等无无加工样加工样品品60g/l60g/l氯化钠氯化钠蛋白胨水蛋白胨水氯化钠多粘菌氯化钠多粘菌素素B B肉汤肉汤NMKLNMKLAPWAPW双

40、料双料APWAPWTCBSTCBSG G染色、氧化酶、动力、染色、氧化酶、动力、O/129O/129、甘、甘露糖、露糖、0% NaCl , 1% NaCl0% NaCl , 1% NaCl、硝酸盐、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱还原、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧、鸟氨酸脱羧等羧、鸟氨酸脱羧等无无FDAFDAAPWAPWTCBSTCBSG G染色、氧化酶、动力、染色、氧化酶、动力、O/129O/129、甘、甘露糖、盐胨水、硝酸盐还原、精氨露糖、盐胨水、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶等酸脱羧酶等API 20EAPI 20E、DNA DNA

41、探针探针或或 PCRPCR单增李斯特菌国内外检验方法单增李斯特菌国内外检验方法方法名称方法名称一次增菌一次增菌二次增菌二次增菌分离分离鉴定鉴定快速方法快速方法SN SN 01840184- -19931993加工MBP30，18-24hEB30，24/48hMMA/OXA（35，24-48h）蓝色菌落；典型运动；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验；硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发酵；动力试验；协同溶血*；血清学检验*；小鼠毒力试验*无未加工EB（30，24/48h）GB/T GB/T 4789.30-4789.30-20032003EB（301，48h）MMA（301，24-48h）蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色镜检（革兰氏染色、典型运动）；生化特性（溶血反应、硝酸盐还原、尿素酶、MR