第八章 细菌和噬菌体重组和连锁

1、1、细菌细胞、细菌细胞 单细胞原核生物单细胞原核生物，细胞比较小，细胞比较小（约（约1-2m长，长，0.5m宽），宽），无核膜，无真正无核膜，无真正的细胞核，只在菌体中央有一个遗传物质集中区的细胞核，只在菌体中央有一个遗传物质集中区称称拟核拟核。 无性繁殖（裂殖法增殖），生长速度快，周期短，无性繁殖（裂殖法增殖），生长速度快，周期短，2020分钟一个世代分钟一个世代。易突。易突变。变。 2、细菌染色体、细菌染色体（1 1）结构）结构: : 单倍体，为单倍体，为环状裸露双链环状裸露双链DNA(基因带或主染色体基因带或主染色体)，以折叠或螺旋状态存以折叠或螺旋状态存在；在；无蛋白质结合，也不形成核

2、小体，所以其染色体的显著特点是：易于接受无蛋白质结合，也不形成核小体，所以其染色体的显著特点是：易于接受带有相同或不同物种的基因或带有相同或不同物种的基因或DNA片段的插入。片段的插入。（2 2）大小：长约）大小：长约25-35000 m(未螺旋未螺旋) )；（3 3）复制方式：着膜复制；）复制方式：着膜复制； 分裂特点：均等分裂，无基因重组。分裂特点：均等分裂，无基因重组。3 3、质粒：、质粒： 1n个独立于染色体存在，并能独立自我复制和决定某些性状的环状个独立于染色体存在，并能独立自我复制和决定某些性状的环状DNA。附加体：附加体：有些质粒能整合到细菌染色体中，在染色体的控制下随染色体有些

3、质粒能整合到细菌染色体中，在染色体的控制下随染色体一起复制，这类质粒称为附加体。一起复制，这类质粒称为附加体。4 4、菌落：、菌落： 单个单个微生物生长繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构微生物生长繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。的子细胞生长群体。2 2、分解代谢功能的突变型（碳源突变型）：、分解代谢功能的突变型（碳源突变型）： 野生型细菌能利用复杂的不同碳源，也能把复杂分子如氨基酸或脂肪酸野生型细菌能利用复杂的不同碳源，也能把复杂分子如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间产物。这些降解功能称分解代谢功能。降解为乙酸或三羧酸循环的中间产物。这

4、些降解功能称分解代谢功能。 一系列降解功能的实现也需要许多基因的表达，其中任何一个基因突变一系列降解功能的实现也需要许多基因的表达，其中任何一个基因突变都会影响降解功能的实现。都会影响降解功能的实现。 突变体不能利用特定的物质或碳元素作为能量来源。突变体不能利用特定的物质或碳元素作为能量来源。 lac 乳糖突变型乳糖突变型 lac gal半乳糖突变型半乳糖突变型 gal 3 3、抗药性突变型（抗生素抗性突变型）、抗药性突变型（抗生素抗性突变型）: :敏感型敏感型：对某种药物缺乏耐受能力的类型（对某种药物缺乏耐受能力的类型（sensitive） 。抗性型：抗性型：对某种药物有耐受能力的类型（对某

5、种药物有耐受能力的类型（resistance）。）。 青霉素青霉素: : Penicillin penr, pens 链霉素：链霉素：Streptomycin strr, strs4 4、抗噬菌体突变型：、抗噬菌体突变型： T1噬菌体噬菌体 Tonr Tons T2噬菌体噬菌体 Ttor Ttos1 1、选择培养法：、选择培养法： 选择培养法是根据菌株在选择培养法是根据菌株在基本培养基基本培养基和和营养（补充）培养基营养（补充）培养基上的生长表现上的生长表现将菌株分为将菌株分为原养型原养型( (也称为原生营养型也称为原生营养型) )与与营养缺陷型营养缺陷型( (在基本培养基上不在基本培养基上不

6、能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长) )。 其它突变类型的筛选、鉴定：其它突变类型的筛选、鉴定： 对于其它的突变类型对于其它的突变类型( (如温度敏感型如温度敏感型) )，也可以通过，也可以通过培养条件培养条件的选择培的选择培养来筛选与鉴定。养来筛选与鉴定。培养基的类型：培养基的类型：l 基本培养基基本培养基：凡能满足某一菌种：凡能满足某一菌种野生型野生型菌株营养要求的菌株营养要求的最低成分最低成分的的 组合培养基。组合培养基。l完全培养基完全培养基：在基本培养基中加入一些富含生长因子的物质，以满：在基本培养基中加入一些富含生长因子的物质，以满 足

7、该菌种足该菌种各种突变型各种突变型的需要。的需要。l补充培养基补充培养基：在基本培养基中：在基本培养基中有针对性有针对性地加上某一种或几种其自身地加上某一种或几种其自身 不能合成的成分，以满足不能合成的成分，以满足相应突变型相应突变型生长需要的培养生长需要的培养 基。基。2 2、影印培养法：、影印培养法：为高效检测、分离混和群为高效检测、分离混和群体中不同突变型，体中不同突变型，黎德伯黎德伯格夫妇格夫妇设计了影印培养法；设计了影印培养法；该方法原理与选择培养法该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印法将一致，但是采用影印法将在在完全培养基完全培养基上单菌落上单菌落同同时接种时接种到不同到不同选

8、择培养基选择培养基上，同时对所有菌落进行上，同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大选择培养，鉴定效率大大提高。提高。 v 建立纯系的方法纯培养纯系：由单个细胞繁殖而来的菌落称为纯系。菌种纯：采用平板表面涂布法或划线法获得单株菌落。这种方法获得的纯系，称为“菌种纯”。菌株纯：利用显微操纵器进行菌丝尖端切割等方法获得单个细胞，并直接培养建立纯系，这种方法获得的纯系称为“菌株纯”。病毒根据宿主划分：病毒根据宿主划分：植物病毒植物病毒动物病毒动物病毒 细菌病毒一般称为细菌病毒一般称为噬菌体噬菌体. .l 根据噬菌体与宿主细胞的相互关系，可分为：根据噬菌体与宿主细胞的相互关系，可分为：（一）（一）烈性

9、噬菌体烈性噬菌体（virulent phagevirulent phage）：）：仅有裂解周期。仅有裂解周期。侵入宿主细胞后，利用宿主细胞内的物质进行自身遗传物质和蛋白侵入宿主细胞后，利用宿主细胞内的物质进行自身遗传物质和蛋白质的合成，组装出子噬菌体，质的合成，组装出子噬菌体，使宿主细胞裂解而释放子噬菌体使宿主细胞裂解而释放子噬菌体，这，这类噬菌体称为烈性噬菌体。类噬菌体称为烈性噬菌体。 如如T噬菌体系列（噬菌体系列（T1T7）（二）（二）温和性噬菌体：温和性噬菌体：既有裂解周期，又有溶原周期。既有裂解周期，又有溶原周期。 侵入后侵入后并不使并不使细菌裂解，其细菌裂解，其DNADNA不整合到细

10、菌的染色体上，不整合到细菌的染色体上，而是以而是以 质粒的形式独立存在于细胞质内。如质粒的形式独立存在于细胞质内。如P1噬菌体；噬菌体；某些噬菌体侵染细菌后，其某些噬菌体侵染细菌后，其DNADNA整合到宿主染色体中，这种处于整整合到宿主染色体中，这种处于整合状态的噬菌体称为合状态的噬菌体称为原噬菌体原噬菌体。 如如噬菌体。噬菌体。T4噬菌体从噬菌体从大肠杆菌中释放大肠杆菌中释放 塔特姆塔特姆 （19091975） 莱德伯格（莱德伯格（1925） 1958年年诺贝尔奖诺贝尔奖微孔滤板微孔滤板: 大分大分子子(DNA)可通过，细菌可通过，细菌不能通过。不能通过。l经过上述分析可以认为：经过上述分析

11、可以认为：l在在LederberyLederbery和和TatumTatum的试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组的试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为方式，称之为接合接合。遗传物质从供体转移到受体是否为单向转移呢？遗传物质从供体转移到受体是否为单向转移呢？观点：细菌接合是观点：细菌接合是同宗配合同宗配合认为：细菌接合是认为：细菌接合是异宗配合异宗配合A A品系在交配后被杀死并不影响杂交结果，表明它是一种品系在交配后被杀死并不影响杂交结果，表明它是一种供体供体，可以将遗传物质转移给受体，可以将遗传物质转移给受体B B，而，而B B未受链霉素处理，未受链霉素处理，接受接受A A的

12、基因后，可以分裂并在基本培养基中形成菌落。的基因后，可以分裂并在基本培养基中形成菌落。 A A像雄性动物一样，交配后被杀死，不会影响后代。像雄性动物一样，交配后被杀死，不会影响后代。B B品系像是一种品系像是一种受体受体，其可以接受，其可以接受A A的基因，但是的基因，但是B B受链霉素受链霉素处理后不能分裂，所以在培养基上不能形成菌落，同时可以处理后不能分裂，所以在培养基上不能形成菌落，同时可以看到，看到，B B没有遗传物质给没有遗传物质给A A，A A不能在基本培养基中生长。不能在基本培养基中生长。 B B和雌性动物一样，受孕后被杀死的话，就无法产生后代。和雌性动物一样，受孕后被杀死的话，

13、就无法产生后代。说明遗传说明遗传物质的交物质的交换不是相换不是相互的，而互的，而是单方向是单方向的。的。从从A B Hayes Hayes等进一步研究发现，细菌菌株之间的差异是由细胞等进一步研究发现，细菌菌株之间的差异是由细胞内一种内一种致育因子致育因子(fertility factor, (fertility factor, F F因子因子；sex sex factor, factor, 性因子；致育因子性因子；致育因子) )控制的。控制的。F F因子存在的状态：因子存在的状态：以大肠杆菌为例以大肠杆菌为例不含有不含有F F因子的细菌，记为因子的细菌，记为F F （雌性雌性） ；含有含有F

14、F因子的细菌，因子的细菌，F F因子游离于宿主染色体外，记因子游离于宿主染色体外，记为为F F+ + （雄性雄性） ；F因子因子：是可以转移的，能独立增殖的环状：是可以转移的，能独立增殖的环状DNA分子，供体细胞含有分子，供体细胞含有F因子，因子，记作记作F+。 F+的表面有称作性伞毛的细长纤毛，由此与的表面有称作性伞毛的细长纤毛，由此与F-接合。一旦接合。一旦F+与与F- 接触后，性伞毛发生改变，成为两细胞间的原生质通道，称为结合管。接触后，性伞毛发生改变，成为两细胞间的原生质通道，称为结合管。F因因子具有形成性伞毛的基因，因此子具有形成性伞毛的基因，因此F因子还可改变细胞表面的构造，以防止

15、因子还可改变细胞表面的构造，以防止F+细菌间的接合。因此，接合只发生在细菌间的接合。因此，接合只发生在F+与与F-之间，而之间，而F+与与F+间以及间以及F-与与F-间是不会发生的。间是不会发生的。结合管的形成结合管的形成F F+ +细菌通过纤毛与细菌通过纤毛与F F- - 细菌细菌接触并发生相互作用形成接触并发生相互作用形成接合管接合管。F F因子出现缺口，双链之一因子出现缺口，双链之一从原点断裂，以原点为先导，从原点断裂，以原点为先导，从断端转移从断端转移F F因子的因子的一条链一条链到到F F- - 细菌中。细菌中。在在F F+ +和和F F- -细胞中，细胞中，F F因子因子边转边转移

16、边进行两条链的移边进行两条链的复制复制（滚（滚环复制）。环复制）。接合过程：接合过程：F F因子通过接合管转移因子通过接合管转移完毕，完毕，DNADNA的合成也的合成也完成。完成。接合管消失，细胞分开，接合管消失，细胞分开，F F- - 细菌变成细菌变成 F F+ + 。 l F细菌可以把F因子传给后代。l F细菌经吖黄素处理F因子丢失，丢失后不再出现。l F可以和F杂交，而不能和F杂交。l F和F杂交后代皆为F，而且可以以107频率获得重组体后代。 在菌株在菌株A中发现一个新的菌株，跟菌株中发现一个新的菌株，跟菌株B（F-）杂交时，出现重组子的频率很高，几乎比杂交时，出现重组子的频率很高，几

17、乎比F+XF-杂交高杂交高1000倍。此菌株倍。此菌株含有含有F因子，并因子，并且且F因子通过交换整合到宿主染色体中的菌株因子通过交换整合到宿主染色体中的菌株,简称简称Hfr菌株菌株（高频重组菌株高频重组菌株）。）。 1957 1957年，沃尔曼（年，沃尔曼（Wollman.EWollman.E）和雅各布（）和雅各布（Jacob.EJacob.E）设计了著名的中断）设计了著名的中断杂交试验，杂交试验，他们采用的菌株基因型为：他们采用的菌株基因型为： 苏氨酸苏氨酸 亮氨酸亮氨酸 叠氮化钠叠氮化钠 噬菌体噬菌体 乳糖乳糖 半乳糖半乳糖 链霉素链霉素 HfrHfr： thrthr+ + leu le

18、u+ + azi azir r ton tonr r lac lac+ + gal gal+ + str strs s F F- - ：thrthr- - leu leu- - azi azis s ton tons s lac lac- - gal gal- - str strr r中断杂交技术中断杂交技术：基因从：基因从Hfr Hfr 细胞按次序转入细胞按次序转入F F- - 细胞，根据供体基因进入受体细胞，根据供体基因进入受体 细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。不同时间取样不同时间取样搅拌振荡，搅拌振荡，中断杂交中断杂交稀释菌液，防止其再度结合稀释菌液，

19、防止其再度结合 含链霉素的完全培养基含链霉素的完全培养基 杀死杀死HfrHfr细菌细菌Strr 细菌菌落细菌菌落影印培养法：影印到只添加影印培养法：影印到只添加azi、gal等不同选择性培养基上培养，等不同选择性培养基上培养， 鉴定各基因转移的时间。鉴定各基因转移的时间。将将HfrHfr与与F F- -同时加入装有完全培养基的大试管中混合培养同时加入装有完全培养基的大试管中混合培养 结果如下结果如下: :该方法主要根据基因转移的先后该方法主要根据基因转移的先后次序，次序，以时间（以时间（min）为单位）为单位，求基因间的遗传距离。求基因间的遗传距离。Hfr菌株的基因是按一定的菌株的基因是按一定

20、的线性线性顺序顺序从原点依次进入从原点依次进入F菌株的，菌株的，不同基因在不同基因在F中出现的时间和中出现的时间和达到的稳定转移频率不同，达到的稳定转移频率不同，基基因位点离原点（基因位于染色体上，因位点离原点（基因位于染色体上，染色体从一端开始，称为原点或染色体从一端开始，称为原点或O，以线性方式进入，以线性方式进入F-细胞）愈细胞）愈近，进入近，进入F细胞愈早，反之则晚。细胞愈早，反之则晚。 thr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ 8min + 8.5min + + 9min + + + 11min + + + + 18min + + + + + 25min + + +

21、 + + +随时间的推迟，某个随时间的推迟，某个基因的重组率（出现基因的重组率（出现频率）增加；频率）增加；一定程度后，重组率一定程度后，重组率便不再增加。便不再增加。 ii具有具有Hfr菌菌株标株标记基记基因的因的菌落菌落数数%F因子插入的位置及方向因子插入的位置及方向大肠杆菌的大肠杆菌的4种种Hfr菌株的基因转移顺序很不相同菌株的基因转移顺序很不相同重组区：重组区：4 4个插入序列（个插入序列（insertion sequence, insertion sequence, ISIS），插入整合有插入整合有极性极性。自主复制区自主复制区：转移的起点（原点，转移的起点（原点，O O）；）；2

22、2个复制起点（个复制起点（OriOri T T；OriOri V V）；Ori T是在染色体转移时进行滚环复制时的复制起点，也是转移起点。Ori V是在营养时期，即游离在细胞质中独立复制时的复制起点。DNA复制酶基因；复制酶基因； 接合转移区接合转移区：长：长33 Kb33 Kb，性伞毛基因群。，性伞毛基因群。F F因子：因子：是一种质粒，由共价环状闭合是一种质粒，由共价环状闭合双链双链DNA构成，全长构成，全长94.5 Kb94.5 Kb，主要包括：，主要包括：F F因子的插入与因子的插入与HfrHfr染色体的极性染色体的极性 同一个同一个HfrHfr菌株的转移起始点以及转移顺序在不同实验中

23、都是相同的，但菌株的转移起始点以及转移顺序在不同实验中都是相同的，但一个一个F F+ +品系可产生许多品系可产生许多HfrHfr品系。品系。 这是因为这是因为F F因子因子与细菌主染色体交换整合时，与细菌主染色体交换整合时，F因子的因子的IS与主染色体的与主染色体的IS配对。由于配对。由于 主染色体的主染色体的IS有多个，有多个，F因子的因子的IS与主染色体的哪个与主染色体的哪个IS配对；配对； F因子的因子的IS插入取向如何插入取向如何 就导致产生的就导致产生的Hfr的转移起点的转移起点、基因转移顺序基因转移顺序以及以及转移方向转移方向都不相同。即都不相同。即由于由于F因子的插入，使因子的插入，使主染色体具有了极性。主染色体具有了极性。HfrHfr细胞和细胞和F F- -细胞之间的接合管常会自发断裂，进入的细胞之间的接合管常会自发断裂，进入的HfrHfr染色体也随之断染色体也随之断裂，一般说很少有整条裂，一般说很少有整条HfrHfr染色体转入染色体转入F F- -细胞的，转移到受体的部分只是细胞的，转移到受体的部分只是靠近原点的一部分，靠近原点的一部分，F F因子的主要部份在最后进入受体，所以因子的主要部份在最后进