分子生物学简答题复习

1、1 .比较原核生物和真核生物的DN收制有哪些异同点？答:真核细胞和DN收制和原核细胞DN收制十分相似，主要不同点：（1）真核细胞DN收制是多起点，复制叉移动速度较慢，但总速度比原核更快；（2）真核细胞至少有5种DNAK合酶，都能从5'-3'方向合成DN颂，而原核细胞主要的复制酶是DN臊合酶m；（3）真核细胞染色体的末端DNA（端粒）由端粒酶完成复制，原核细胞没有。2 .DNAHH呆留复制是如何被证实的？答:DNA半保留复制是Meselson和Stahl于1958年首先证实的，采用的方法为稳定同位素标记和密度梯度离心技术。将大肠杆菌连续12代培养在以15NHCL为唯一氮源的培养基

2、中以使所有DN的子土被15N标记，然后将15N完全标记的大肠杆菌转移到14N培养基中逐代分别培养。分别收集15n全标记和15n全标记后在14N培养基中培养一代、二代等各自的DNA并进行氯化葩密度梯度离心，可得到高密度带（15n带），中密度带（15n14N带）和密度逐渐接近最低密度（14N带），由此得知DNA半保留复制的，即子代DN/W链一条是亲代的，一条是新合成的。3H脱氧胞音标记实验和以后的其它方法均证实了DNAH呆留复制。3 .简述维持DNAS制高度忠实性的机制。答:维持DNAS制的高度忠实性的机制主要包括：（1）严格遵守碱基配对原则。（2）DN咪合酶在复制延长中对碱基的选择功能。（3）D

3、N咪合酶具有的3'-5'外切酶的活性，可进行自我校对，以切除复制中错误掺入的核甘酸。（4）使用RNA乍为引物，可以降低复制开始阶段所发生的错误。4 .描述E.Coli的DN咪合酶I在DNAM制中的作用。答:大肠杆菌DNAK合酶I是一个多功能酶，由一条多肽链组成。其功能是：（1）催化DNAS密古5'-3'方向延长；（2）具有3'-5'外切酶活性，对不能形成碱基对的错配核甘酸可水解切除；（3）具有5'-3'外切酶的活性，能从一条链5'端开始水解，用于除去RN用I物。该酶经蛋白酶水解可断裂成大、小两个片段。前者含有聚合酶和3&#

4、39;-5'外切酶活性，后者只有5'-3'外切酶的活性。5 .复制的起始过程如何解链？引发体怎样形成？答:E.coli的oriC位点上有特征的序列可被DnaA蛋白结合而使双链打开，DnaBC蛋白进一步结合使双链更为展开，在此基础上，引发酶及其辅助蛋白结合在开链DNAk,形成引发体。6 .简述DNAS制中，后随链是怎样合成的？答:在DNAM制中，后随链是不连续合成的。因为DNAK合酶只能按5'-3'方向合成DNA后随链不能象前导链那样朝同一方向合成，而是按5'-3'方向（与复制叉移动方向相反）由DNA5合酶田合成冈崎片段，相邻的冈崎片段被R

5、N刈物隔开，DN咪合酶I去除RN闻|物，并用DNAR补空隙，再由DN啦接酶将片段连接起来。在真核生物，后随链由DNAK合酶a通过冈崎片段合成7 .简述真核生物线性DNAM制后如何解决5'端缩短的问题?答：(1)所示磷酸(P)是在它所连片段的5'末端。(2)切口会通过连续的DN砥复合成填上，从缺口链所示的-O制开始，沿5'一3'方向进行，直到达相邻片段的磷酸基团部位。在缺少DNA!接酶时，缺口填上后，两个片段仍不能相连。8 .简述DN做螺旋的类型？大小沟0的生物学意义？1.比较复制与转录异同点。【论述题答案】1 .(1)复制与转录不同点：复制力式半保留复制不对称转

6、录模板单链DNA模板链原料4XdNTP4XNTP主要酶和蛋白质因子依赖DNA的DN咪合酶、解螺旋酶类、连接酶、引物酶、拓扑异构酶依赖DNA勺RNA聚合酶、p因子等引物一段RNA无碱基配对A-T、G-CA-U、G-C、T-A产物子代DNA3种RNA产物加工无剪接、修饰等(2)复制与转录相同点：以DNA模板；以核甘酸为原料；合成方向5'一3'遵循碱基配对原则；依赖DNA勺聚合酶；产物都是多核甘酸链。2 .试述原核生物转录过程。分起始、延长、终止三个阶段。(1)起始：在原核生物中，当RN咪合酶的6亚基发现其识别位点时，全酶就与启动子的一35区序列结合形成一个封闭的启动子复合物。由于全

7、酶分子较大，其另一端可到一10区的序列，在某种作用下，整个酶分子向一10序列转移并与之牢固结合，在此处发生局部DNAl2-17bp的解链，形成全酶和启动子的开放性复合物。在开放性启动子复合物中，起始位点和延长位点被相应的核音酸前体充满，在RN咪合酶B亚基催化下形成RNA勺第一个磷酸二酯键。RNA&成的第一个核甘酸总是GTMATP,以GTP见。前面9个核甘酸的合成不需要RNA聚合酶移动。亚基从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的6亚基与另一个核心酶结合成全酶反复利用。延长：RN颂的延长靠核心酶的催化，RN颂的合成方向是5'-3'。终止：当核心酶沿模板3&

8、#39;-5'滑至终止信号区域，转录终止。DNA真板上的转录终止信号有两类：一类是不依赖于蛋白质因子而实现的终止作用；另一类是依赖蛋白质辅因子才能实现终止作用，这种蛋白质辅因子称为释放因子，通常又称P因子。3 .试述RNA专录体系的组成及各成分的作用。（1） DNA1转录模板：双链DN份子中只有一条链作为转录模板，指导转录生成RNA此链称为模板链，其方向为3'-5'。另一条链无指导转录功能，称为编码链。对不同基因而言，模板链并非永远在同一单链上。rnA专录为不对称转录。（2）原料：四种NTP（ATRGTRUTRCTP是合成RNA勺原料。各核甘酸之间通过3',5&

9、#39;磷酸二酯键相连聚合。聚合方向5'-3'。（3） RNAg5合酶：大肠杆菌的RNA5合酶：四种亚基（a、0、B'、）组成。亚基的功能：a亚基：决定基因转录的特异性B亚基：参与转录的全过程B'亚基：与DNA真板结合的组分亚基：识别DNA真板上转录起始点四种亚基构成两种RNA聚合酶形式：全酶（a2BB'b），具有识别转录起始点的作用，转录起始由全酶催化；核心酶（a20B'）,是转录延长阶段所需的酶，能沿模板由3'-5'方向移动，RNA从5'-3'方向延长。原核生物只有一种RN咪合酶，RS化三种RNAW合成。真核生

10、物的RN咪合酶：有三种，称为RNA聚合酶I、n>m,专一性地转录不同基因，相应转录产物分别为：45S-rRNA（5.8S、18s28S-rRNA的前体）；hnRNA（mRN的体）；RN咪合酶田白产物为snRNAtRNA及5S-rRNA（4） p（Rhci）因子：是参与原核生物转录终止的蛋白质因子，它可识别DNA上的转录终止部位，促进转录终止。1 .从高等生物基因组中克隆的完整基因为什么在大肠杆菌中不能正确表达？.答：真核基因启动子不能被原核RNA5合酶识别转录不能正确起始；从真核基因组克隆的基因含有内含子，大肠杆菌没有转录后剪接系统。2 .转录和复制过程有什么相似之处？又各有什么特点？答

11、：转录和复制都以DNA为模板，都需依赖DNA的聚合酶，聚合过程都是在核甘酸之间生成磷酸二酯键，新生链的方向都是5'-3',都需遵从碱基配对规律。不同的是：复制使子代保留亲代全部遗传信息，而转录只需按生存需要部分信息表达，即对DNA链有选择性。复制和转录的聚合酶分别是DNA-pol和RNA-pol;底物分别是dNTPffiNTR复制的产物是两对DNA®链（每对是半保留的），转录的产物有mRNAtRNA和rRNA等单链；在碱基配对上，复制是A-T,G-C配对，而转录的RNA!中的U代替了To3 .原核生物和真核生物的RN咪合酶有何不同？答：原核生物RN咪合酶通常只有一种，

12、彳S化合成所有类别的RNA该酶由多亚基组成，全酶是a20B*核心酶是a20B,专一抑制剂是利福平。真核生物RN咪合酶有3种，RN咪合酶I合成丫RNAmi体；RN咪合酶II合成mRNA前体(hnRNA,RNA聚合酶田合成小分子RNA(tRNA,5S-rRNAsnRNA,它们专一抑制剂是鹅膏蕈碱。4 .比较真核生物和原核生物转录起始的第一步有什么不同？答：在原核生物中，转录起始关键是RNA®合酶与DNAB相互彳用。RN咪合酶的核心酶可以催化NTP的聚合，但只有全酶能够引发转录的开始。主要步骤是：具有特异识别能力的亚基识别转录起始点上游的启动子特异同源序列，这样可以使全酶与启动子序列结合力

13、增加，形成封闭的二元复合物。真核生物中，RNA聚合酶不与DNA分子直接结合，转录起始主要是RNA聚合酶与蛋白质之间的作用。即转录因子与DNA相互作用时，其他因子也结合上来，形成起始复合体，这一复合体再与RNAK合酶结合。5 .简述原核生物的两种终止转录的方式。答：原核生物转录终止有依赖P与非依赖P两种方式。p因子有ATP酶和解螺旋酶两种活性，与mRNARNA-pol结合后使RNA-pol变构，从而使RNA-pol停顿不再前移，用解螺旋酶活性使RNA3端与模板链的DN的开，从而RNA兑落。非依赖P因子的转录终止主要依赖RNA3端的茎环(发夹)结构及随后polyU,茎环结构生成仍被RNA-pol包

14、容，且使RNA-pol变构不能前进，polyU与模板polyA序列是最不稳定的碱基配对，当酶不再前移，DNA®链就要复合，导致RNA链脱落。6 .转录起始复合物和“转录泡”有何区别？为什么会形成“转录泡”？答：转录起始复合物是在转录起始时由RNAIK合酶、DNA1板和第一位加入的核甘酸组成的，还没有生成RNAS。“转录泡”是转录延长过程中观察到的，在转录泡内，DNW链被解开，以允许转录发生，转录的RNAf它的模板链形成暂时的RNA-DN煤交双螺旋，当RNRA中脱落后，DNA新缠绕成双链。7 .一条单链(+)DNA的碱基组成为：A21%,G2%,C29%,T21%,用DNAK合酶复制出

15、互补的(-)链，然后用RNAIK合酶和DNA(-)链为模板进行转录，指明产物的碱基组成成份。.答：转录的RNA®基组成成分是：A21%G29%C29%U21%1 .简述三种RNAt蛋白质合成中的作用。(1) mRNA作用：以一定结构的mRN将为直接模板合成一定结构的多肽链时，就是将mRNAh带有遗传信息的核甘酸顺序翻译成氨基酸顺序的过程，即mRNA是通过其模板作用传递遗传信息，指导蛋白质的合成。(2) tRNA的作用：tRNA是转运氨基酸的工具。作为蛋白质合成原料的20种氨基酸各有其特定的tRNA,而且一种氨基酸常有数种tRNA来运载。(3) rRNA的作用：它和蛋白质结合成核蛋白体

16、，是蛋白质合成的场所。2 .试述复制、转录、翻译的方向性。(1)复制的方向性：DNA复制的起始部位称复制子。每个复制子可形成两个复制叉，如模板单链DNA3一5'的方向与复制叉方向相同，则是连续复制；如果模板方向和复制叉方向相反，则DN的成为不连续合成。(2)转录的方向性：DNA真板方向是3'一5'转录为RNA勺方向是5'一3'。(3)翻译的方向性：核蛋白体沿mRNAk5'一3'方向进行翻译，所合成的多肽链方向是由N端向C端进行。3 .简述原核生物蛋白质翻译延长过程。(1)进位：氨基酰-tRNA根据遗传密码的指引，进入核糖体A位；(2)转肽

17、(成肽)：在转肽酶作用下，将P位点上肽酰基转移到A位点氨基酰-tRNA上，在A位形成肽键，肽链延长；(3)转位(移位)：游离tRNA离开P位点，在A位上新形成肽酰-tRNA又移到P位上，同时核糖体在mRNAb以5'-3'移动三个核甘酸距离，下一个密码子置于A位点。1,真核生物与原核生物蛋白质合成过程的不同点是什么?真核生物原核生物mRNA(1) 翻译与转录不偶联，mRNA!力口工修饰(2) 有“帽”及聚A“尾”，无S-D序列，为单顺反子(3) 较稳定，易分离翻译与转录偶联无“帽”与聚A“尾”，但5'-末端起始密码上游有S-D序列,为多顺反子半寿期短，不稳定，不易分离核蛋

18、白体(1)沉降系数为80S小亚基是40S,含18SrRNA及33种蛋白质大亚基为60S,含5S、5.8S、28S三种rRNA及49种蛋白质(4)小亚基上的18SrRNA无70S30S,含16SrRNAM21种蛋白质50S,含5s23SR#rRNAM31种蛋白质16SrRNA3末端有与mRNA5-末端的S-D序列相互补的碱与mRNAffi结合的区域基序列tRNA具有起动作川的tRNA是非甲酰化的Met-tRNAimet甲酰化的Met-tRNAmet(fMet-tRNAfmet)合成过程：起始延长（1）起始因子（eIF）10余种（2）小业基先与非甲酰化的Met-tRNAimet结合，再与mRN船合

19、协助氨基酰-tRNA进入AIF后二种小亚基先与mRNA再结合fMet-tRNAfmet进位是EFT（由Tu和Ts两个亚终止位的是eEF1,移位的因子称eEF2只有一种释放因子（RF）,识别三种终止密码基组成），移位需EFG有二种RF,RF1识另UAAUAGRF2识另1JUAAUGARF3协助二者起作用。1 .简答核糖体的结构与功能。答：核糖体是由多种蛋白质和核糖体RN阁合而成的核蛋白体颗粒，有大小两个亚基组成.其功能是参与蛋白质的合成的启动，肽链的延伸、终止等过程，但这种合成过程必须与mRNA吉合后才能发挥作用，即核糖体的小亚基有与mRNA结合的能力，负责对顺序的特异识别。大亚基上有两个结合t

20、RNA的位点，一个为供位或称肽酰基位（P位点）可与延伸中的多肽酰-tRNA结合；另一种称受位或氨基酰位点（A位点），可与新掺入的氨酰-tRNA结合。两位点是活化氨基酸准确地入座和形成肽链的位置。2 .简答tRNA在蛋白质合成过程中的功能。答：识别特异性很强的AA-tRNA合成酶，并在此酶的作用下结合氨基酸；识别核糖体，将带有氨基酸的tRNA结合到核糖体上面；以其反密码解读mRNAh的密码，以将携带的氨基酸放在多肽链的适当位置；识别起始密码子和校正mRNA上因缺少或插入一个核甘酸发生无义或错义突变。3 .什么是“三联体密码"？mRNAL的遗传密码为AUGGACGAAUAGUG能肽链的氨

21、基酸排列顺序为？答：mRNAh每三个核甘酸释成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，称这三个核甘酸为三联体密码。多肽链的顺序为：Met-Asp-Glu4 .以GC两种多个核甘酸任意排列的共聚多核甘酸作模板时，可出现哪几种三联体？怎样测知每个三联体所代表的密码氨基酸？答：出现GGGGGCGCGCGCCCCCCGCGGGC曲八种三联体。以多聚C或G和特定多聚CG或CCG£GG暇模板加入无细胞体系测其合成的多肽是由什么氨基酸构成即可推知每个三联体的密码。5 .简述蛋白质生物合成的过程。答：蛋白质合成的过程分5步：氨基酸的活化；肽链合成的起始；肽链的延伸；肽链合成的释放与终止；肽链合成后的加工与处理。

22、1.简述基因工程的主要过程。1 .(1)目的基因的获取(2)克隆载体的选择与构建(3)目的基因与载体的连接(4)重组DNA子导入受体细胞(5)重组体的筛选鉴定(6)克隆基因的表达2 .什么是载体？可分几类？载体是为携带外源基因，实现外源基因的扩增或表达所采用的DNA分子。可分为质粒、噬菌体、粘粒、病毒等。3 .pUC质粒有何特点？(1) pBR322的氨苇青霉素抗性基因和复制起始位点。(2)大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因、启动子、操纵基因及lacZ/基因片段。4 .采用哪些方法可获取目的基因？基因组DNAi库制备cDNAi库PCR化学合成5 .目的基因与载体的连接有哪几种方法？主要有以下四种(1

23、)粘性末端连接(2)同聚物加尾连接(3)平末端连接(4)人工接头连接6 .重组体主要有哪些筛选和鉴定方法？(1)遗传学方法(2)分子杂交方法(3)免疫学方法7 .分子杂交的基本原理是什么？有哪些基本方法？分子杂交的基本原理：核酸分子杂交技术是基于具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下碱基互补配对结合，形成双链的原理。在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。基本方法：Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点印迹原位杂交8 .常用的探针标记物有哪些？常用的标记物有放射性核素：32p、35s、3h、125i

24、、131I等和非放射性核素有地高辛、生物素、荧光素和酶等非放射性核素。1 .何为PCR试述其基本原理。1. PCRX称基因体外扩增特定序列方法。是在反应体系中加入模板DNAdNTP特定设计的引物及耐热的DNA聚合酶，经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的DNAg指数形式合成的过程。基本原理：PCFT增首先需要一对引物，根据待扩增区域两端已知序列合成两个与模板DNA互补的寡聚核甘酸引物，这一单链引物的序列将决定扩增片段特异性和长度。PCR5应体系有基因组DNA一对引物、dNTPTaqDNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必需的离子强度等组成。反应在加热变性、使基因组双链DNA变性为单链后，通过降低温度使

25、特异引物与互补的DNA序列特异结合(退火或复性)后在耐热TaqDNAt合酶作用下，以基因组单链DNM模板，从引物端开始按5'-3'方向合成DNA(延伸)。这样经过变性-复性-延伸三步为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之问新生DNAt段理论上达到230拷贝，约109个分子。2 .DNA芯片技术的基本原理及应用。基本原理：将大量已知道寡核甘酸或DNA探针按特定的排列方式固化在固相支持物表面，按碱基互补配对的原则，与标记的特异的单链DNA或RN6子杂交形成双链，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品分子的数量和序列信息。DNA芯片上固定的探针

26、可以是cDNA寡核甘酸或来自基因组的基因片段，且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列，因此，DNA®片又被称为基因芯片、DNA阵列、cDNA®片、寡核甘酸阵列等。应用：(1)DNAff列测定(2)突变及多态性分析(3)基因表达分析(4)基因组研究(5)基因诊断(6)药物研究与开发3、简述分子杂交的一般程序？1) DNA和RNA勺杂交制备DNA或RNA羊品f与固定基质结合-80c真空固定-预杂交-加入标记探针杂交-洗涤-放射自显影或显色反应。2)蛋白质的免疫分析制备蛋白质样品-与固定基质结合-常温空气中固定-封闭剂封闭-一抗反应-洗涤-二抗-酶偶联物反应-洗涤-显色反应(EI

27、A)或抗放射标记物洗涤放射自显影(RIA)4、简述Southernblotting基本方法？将DN雨本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相又t位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNAt段的位置和大小。5、分子杂交检测常用的探针类型有？分子杂交检测其互补序列的标记DNARNAff列，能在许多DNARNAff列的复杂混合物中识

28、别所需克隆的分子。DNA®针(DNAprobe)RNA®针(RNAprobe)简并探针(degenerateprobe)6、生物芯片的一般类型包括那些，举例说明？或填空？1） 按照芯片基质上固定的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为DNA戈基因芯片、蛋白质芯片、RNAK片、细胞芯片、组织芯片、芯片实验室(Labonchip)。如果芯片上固定的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋白芯片；如果芯片上固定的分子是寡核甘酸探针或DNA就是DNA®片。根据生物化学反应过程，又可以将生物芯片进行另外一种分类：因为通常的生物化学反应过程包括三步：即样品的制备、生化反应、结果检测和分析。

29、所以我们可以根据这三个不同的步骤，把生物芯片分为不同的类型即用于样品制备的生物芯片，生化反应生物芯片及各种检测用生物芯片等。按照芯片上基因探针的密度又可将基因芯片分为高、中、低密度三种。按照芯片上固定的核酸大小可以分为三种类型、两种模式：寡核甘酸芯片、cDNA芯片和基因组芯片。7、对于人类来说，SNP的意义在于哪些？1、致病SNP2、疾病易感性SNP3、具有诊断价值的SNP4、疾病的SNPi普5、人表型相关SNP6、药物作用与不良反应的SNP7、药物剂量SNP8、请解释什么是基因组DNA3t库(genomicDNAlibrary)?利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体

30、连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNAJ息，总称基因组DNW库cDNAt库（cDNAlibrary）:以mRNA；模板，利用反转录酶合成与mRNAL补的DNA再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA言息，总称cDN©库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。9、请简述构建基因文库的基本程序？1）提取研究对象基因组DNA制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNAf反转录成cDNA2） DNA片段或cDNAt段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA3）重组DNA专化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。10

31、、重点简答题：一个理想的基因组DNAt库应具备下列条件？重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸载重组克隆能稳定保存、扩增、筛选等后续操作11、自身引导合成第二链的原理怎样？首先用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNAg,解离的第一链cDNA的3'-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链cDNA合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是由帽子的特殊结构相关），这个发夹结构可以作为引物并引导DNA聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利

32、用S1核酸酶将连接处切开（仅该位点处为单链结构，切断形成平端结构，可以进行后续连接反应）。12、重点论述题：在PCR寸，简述前三个周期中的重要变化？第一周期中，合成的每一条新生链都超出了另一个引物的位置；在第二个周期中，通过同样的变性、复性、延伸步骤，进行新一轮的扩增，以第一周期中合成的DNA为模板合成的DNAa于两引物位置之间，这就是所需扩增的特异DNAt段；在第三个周期中，经过同样的变性、复性、延伸步骤进行扩增，在第三个周期中，经过同样的变性、复性、延伸步骤进行扩增，以第二轮中的新生链为模板，就形成特异DN敬链，以后每增加一轮，它扩增一倍，是指数扩增13、较重点论述题：荧光定量PCR勺原理

33、采用的是什么？主要原理：是在待扩增区域（模板DNA结合上DNAK车+,PCRS程中，具有5'-3'外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNAK针时,将DNAf针逐个降解，释放出荧光报告基团，可以发出荧光，而且PCR体系中发出荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系,可通过测定荧光强度而对PCFT物定量RT-PCR是反转录酶PCR其技术原理是将一段待测的RNA序列经反转录酶的作用转录成cDNA再利用PCR技术将基因片段以几何级数倍增的方式增加到数十万倍，所形成的PCFS因产物经一种叫Ethidiumbromide的化学物质作用，利用其会与DNA嵌合，经紫外灯照射时会发出肉眼可见的萤光

34、，即在电泳胶片上会呈现具有特定分子量的PCR!因片段的产物。14、较重点论述题：论述蓝白斑筛选原理？这类载体通常含有大肠杆菌B-半乳糖甘酶基因lacZ的N端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物为B-半乳糖甘酶的a链；而所用的宿主菌通常用lac缺失突变型的大肠杆菌，该菌可表达该酶的片段（酶的C端区）。当空载体或者自身环化的载体转入宿主细胞时，B-半乳糖甘酶的a、两个片段能同时表达，发生互补，形成完整且具有活性的B-半乳糖甘酶，后者可使人工加入的底物X-gal转变为蓝色；如果外源基因插入到载体的lacZ民片断的基因内，由于插入失活，形成的重组子即使转入lac-大肠杆菌也不能形成完整的B-半乳糖甘

35、酶，表现为重组菌在含X-gal的培养基上生长时成白色菌落。这一现象称a-互补，可用于重组体筛选，又称蓝、白斑实验。15、FRET勺理论基础？Forster提出了共振转移理论两个分子的振动频率相同，可发生能量转移（就好像一个振动的音叉可引起附近另一具有相同频率的另一音叉振动一样），因此称共振能量转移。16、超难度论述题：当一个基因片段的核音酸序列测定以后，我们一般应认真做好哪些数据分析？1）将所有的核甘酸序列按测序策略图排列基因序列；2）利用DNA序列分析软件制作限制酶图，并与直接作图法所获图谱进行比较；3）利用DNAff列分析软件进行基因启动子，核糖体结合序列以及基因表达调控序列的分析；4）利

36、用DNA序列分析软件或直接将序列与Genbank中的数据进行同源性比较;5）利用DNAff列分析软件进行ORF勺分析，并推断出相应的蛋白质序列；6）利用DNA序列分析软件进行蛋白质中信号肽，糖基化位点，同源性分析等。17、酵母双杂交系统的原理将编码某一蛋白X的DNAff歹J与DN匐合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，同时将编码另一蛋白Y的DNAJ列与DNA敷活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，然后将两个杂交体转染酵母细胞，这个酵母细胞含有一个报告基因，报告基因上游存在转录因子的结合位点的，若x和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有

37、效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此，可通过检测报告基因的转录与否来研究蛋白质x和Y的相互作用。18、什么是基因敲除技术（geneknock-out/down）?又称基因打靶(genetargeting)。这种技术是通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代(又称基因敲入)然后从整体观察实验动物，从而推测相应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。19、什么是定点突变？定点突变(sitedirectedmutagenesis)是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核甘酸序列来改变所编码的氨基酸序列，

38、常用于研究某个(些)氨基酸残疾对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNAM控元件特征序列、维修表达载体、引入新的酶切位点等。20、超难度论述题：如何对对传统RAC豉术的改进？主要是引物设计及RT-PCRK术的改进1、利用锁定引物(lockdockingprimer)合成第一链cDNA即在oligo(dT)弓I物的3'端引入两个简并的核甘酸5'-Oligo(dT)16-30MN-3M=A/G/C;N=A/G/C/T,使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；2、

39、在5'端加尾时，采用poly(C),而不是poly(A)3、采用RNaseH-MMLV(莫洛尼氏鼠白血病毒反转录酶)或选择嗜热DN咪合酶可能在高温(60度-70度)有效地逆转录mRNA从而消除了5'端由于高CC含量导致的mRNAT级结构对逆转录的影响4、采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR提高PCR反应的特异性1 .在什么条件下，RNAIK合酶在乳糖操纵子中的活性最大？在低葡萄糖、高乳糖条件下，乳糖作为诱导剂与阻遏蛋白结合而抑制其活性，而低葡萄糖浓度使胞内cAM咏平增高，后者与CAP而激活其活性。cAMP-CAPS合物与启动子结合

40、，对Lac操纵子起正性调控作用，使转录活性最大2 .举例说明基因表达的时间特异性和空间特异性。基因表达的时间特异性是指基因表达严格按照特定的时间顺序发生，以适应细胞或个体分化、发育各阶段的需要，故又称阶段特异性。如一个受精卵含有发育成一个成熟个体的全部遗传信息，在个体发育分化的各个阶段，各种基因高度有序地表达，一般在胚胎时期基因开放的数量最多，随着分化发展，细胞中某些基因关闭、某些基因转向开放。基因表达的空间特异性是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因的表达在不同的细胞或组织器官不同，从而导致特异性的蛋白质分布于不同的细胞或组织器官，故又称为细胞特异性或组织特异性。例如肝细胞中涉及

41、编码鸟氨酸循环酶类的基因表达水平高于其他组织细胞，其中某些酶(如精氨酸酶)为肝脏所特有，这些酶蛋白的基因表达均呈细胞特异性。3 .举例说明什么是管家基因及其基因表达特点。在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因通常被称为管家基因。例如,三竣酸循环是一枢纽性代谢途径，催化该反应过程的酶蛋白编码基因就属这类基因。管家基因较少受环境因素影响，在个体各生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小，这类基因表达只受启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。4 .结合乳糖操纵子结构，简述阻遏蛋白和CAP®何协同调节结构基因转录。乳糖操纵子是由结构基因及其上游调控序列构成

42、。后者包括操纵序列O启动序列P及调节基因IoI基因能编码阻遏蛋白，该蛋白与O基因结合后，对结构基因转录起负性调控；在启动序列上游还有CAP吉合位点，当CAPtcAMP吉合并活化后，通过与CA眼点结合，对结构基因转录起正性调控。阻遏蛋白的负性调节和CAP®白的正性调节取决于培养液中存在的碳源（葡萄糖/乳糖）水平。当培养液中有葡萄糖而无乳糖（诱导剂）存在时，I基因表达阻遏蛋白，通过与O基因结合，阻遏结构基因转录；当培养液中有乳糖而无葡萄糖存在时，乳糖作为诱导剂，与阻遏蛋白结合而使之变构失活，不能与O基因结合，使结构基因转录，同时，由于胞液中cAMPt曾高，通过与CAP吉合而活化之，后者与CA暇点结合，以加强结构基因的转录。5 .简述原核基因表达调控的特点。（1）6因子的特异启动作用，（2）操纵子调控机制的普遍性，（3）结构基因的多顺反子转录，（4）阻遏蛋白的负调控作用具有普遍性。6 .简述真核基因转录因子分类及功能。（1）通用转录因子：这类转录因子是RNApolR结合