生物化学课件核酸分子杂交53

1、 第一节核酸分子杂交的基本原理第一节核酸分子杂交的基本原理一一核酸的变性与复性核酸的变性与复性二二核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理第二节核酸探针第二节核酸探针一一常见的核酸探针常见的核酸探针二二核酸探针的标记核酸探针的标记第三节核酸分子杂交相关技术第三节核酸分子杂交相关技术 一一传统的核酸分子杂交技术传统的核酸分子杂交技术 二二原位杂交原位杂交 一、核酸的变性与复性一、核酸的变性与复性二、核酸杂交的基本原理二、核酸杂交的基本原理n（一）变性（一）变性n当有酸、碱、热及某些变性剂（如尿素、乙醇、甲当有酸、碱、热及某些变性剂（如尿素、乙醇、甲酰胺、胍等）等变性因素存在时，酰胺、胍等）等

2、变性因素存在时，DNADNA分子双链间分子双链间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNADNA，此现象称为变性（此现象称为变性（denaturationdenaturation）。）。nDNA DNA 变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积不再变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积不再存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，从而使存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，从而使变性后的变性后的DNA DNA 对对260nm 260nm 紫外光的吸光率比变性紫外光的吸光率比变性前明显增加，这种现象称为增色效应前明显增加，这种现象称为增色效应（hyperchromic effe

3、cthyperchromic effect）。）。 n核酸在变性过程中，除紫外吸收值变化之外，核酸在变性过程中，除紫外吸收值变化之外，还有粘度下降、沉降系数增加、比旋度降低、还有粘度下降、沉降系数增加、比旋度降低、生物活性丧失等生物活性丧失等（二）复性（二）复性 n去除变性因素后，单链去除变性因素后，单链DNADNA能通过碱基互补重新结合成稳定的双链能通过碱基互补重新结合成稳定的双链螺旋结构，此过程称为复性（螺旋结构，此过程称为复性（renaturationrenaturation）。）。nDNA DNA 复性后，许多理化性质和生物活性也得到恢复。复性过程基复性后，许多理化性质和生物活性也得到

4、恢复。复性过程基本上符合二级反应动力学，其中第一步是相对缓慢的，因为两条本上符合二级反应动力学，其中第一步是相对缓慢的，因为两条链必须依靠随机碰撞找到一段碱基配对部分，先形成部分双螺旋。链必须依靠随机碰撞找到一段碱基配对部分，先形成部分双螺旋。第二步快得多，尚未配对的其他部分按碱基配对相结合，像拉锁第二步快得多，尚未配对的其他部分按碱基配对相结合，像拉锁链一样迅速形成双螺旋。链一样迅速形成双螺旋。n退火（退火（annealingannealing）：）：热变性热变性DNA DNA 在缓慢冷却时，可以在缓慢冷却时，可以复性，这种复性称为退火。复性，这种复性称为退火。n“淬火淬火”（quenchq

5、uench）：将热变性的）：将热变性的DNADNA骤然冷却时，骤然冷却时，DNA DNA 不可能复性，这是由于温度突然降低，单链不可能复性，这是由于温度突然降低，单链DNA DNA 分子失去碰撞的机会，因而不能复性，仍然保持单链分子失去碰撞的机会，因而不能复性，仍然保持单链变性的状态。将热变性变性的状态。将热变性DNADNA骤然冷却的处理过程叫骤然冷却的处理过程叫“淬淬火火” 。n利用利用“淬火淬火”的原理，在用同位素标记的双链的原理，在用同位素标记的双链DNA DNA 片片段进行分子杂交时，为获得单链的杂交探针，可将装段进行分子杂交时，为获得单链的杂交探针，可将装有热变性有热变性DNA DN

6、A 溶液的试管直接插入冰浴，使溶液在冰溶液的试管直接插入冰浴，使溶液在冰浴中骤然冷却至浴中骤然冷却至0 0 。n影响影响DNADNA复性的因素：复性的因素：nDNADNA的大小及复杂性。的大小及复杂性。DNADNA片段越小、序列越简单，片段越小、序列越简单，复性速率越快。因为片段越大、复杂性越高，单链复性速率越快。因为片段越大、复杂性越高，单链DNADNA分子相互碰撞的几率越少。分子相互碰撞的几率越少。nDNADNA的浓度。的浓度。DNADNA浓度越大，两条互补链相互碰撞的浓度越大，两条互补链相互碰撞的可能性越大，复性的速度也越快。可能性越大，复性的速度也越快。n温度。温度过高，不利于温度。温

7、度过高，不利于DNADNA的复性；温度过低，则的复性；温度过低，则少数碱基配对形成的局部双链不易解离，难以继续寻少数碱基配对形成的局部双链不易解离，难以继续寻找正确的配对。适宜的复性温度是比找正确的配对。适宜的复性温度是比TmTm值低值低2525。n溶液的离子强度。因为盐能中和溶液的离子强度。因为盐能中和DNADNA单链中磷酸基团单链中磷酸基团的负电性，减少互补链的负电荷相互排斥作用，因此的负电性，减少互补链的负电荷相互排斥作用，因此增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。n根据核酸变性和复性的原理，不同来根据核酸变性和复性的原理，不同来源的源的

8、DNADNA变性后，若这些异源变性后，若这些异源DNADNA之间之间存在某些相同序列的区域，在退火条存在某些相同序列的区域，在退火条件下则可形成件下则可形成DNA-DNADNA-DNA异源双链；或异源双链；或将变性的单链将变性的单链DNADNA与与RNARNA经复性处理可经复性处理可以形成以形成DNA-RNADNA-RNA杂合双链。这种不同杂合双链。这种不同来源的单链核酸分子在合适的条件下，来源的单链核酸分子在合适的条件下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程通过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分子杂交（称为核酸分子杂交（molecular molecular hybridizationhyb

9、ridization）。）。D N A2D N A1RNA探针DNA-RNA杂交 DNA-DNA杂交 核酸分子杂交原理示意图核酸分子杂交原理示意图一、常见的核酸探针一、常见的核酸探针二、核酸探针的标记二、核酸探针的标记三、核酸探针的检测三、核酸探针的检测n核酸核酸探针探针(probes)(probes)是指能与待测的靶核酸序列互补杂交的是指能与待测的靶核酸序列互补杂交的已知序列的核酸片段。它具有高度的特异性，并且一般来已知序列的核酸片段。它具有高度的特异性，并且一般来讲带有某种适当的讲带有某种适当的标记物标记物以便检测。以便检测。n根据标记方法不同，核酸探针可被粗分为放射性探针和非根据标记方法

10、不同，核酸探针可被粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；根据性质及来源不同，核酸探针又可放射性探针两大类；根据性质及来源不同，核酸探针又可被分为基因组被分为基因组DNADNA探针、探针、cDNAcDNA探针、探针、RNARNA探针及寡核苷酸探探针及寡核苷酸探针等几类。针等几类。一、常见的核酸探针一、常见的核酸探针图图9 9 RNARNA探针制备示意图探针制备示意图 n由于由于RNARNA探针为单链，杂交时不存在第二条链的竞争，其探针为单链，杂交时不存在第二条链的竞争，其与待测核酸杂交的效率高，灵敏度高。与待测核酸杂交的效率高，灵敏度高。n同时由于同时由于RNA/RNARNA/RNA和和RNA/

11、DNARNA/DNA杂交体的稳定性较杂交体的稳定性较DNA/DNADNA/DNA杂杂交体的稳定性高，杂交反应可以在更为严格的条件下进行，交体的稳定性高，杂交反应可以在更为严格的条件下进行，因而因而RNARNA探针的特异性高。探针的特异性高。nRNARNA探针适合于探针适合于NorthernNorthern杂交、原位杂交等。杂交、原位杂交等。n主要缺点是不稳定，易被降解。主要缺点是不稳定，易被降解。二、核酸探针的标记二、核酸探针的标记核酸探针核酸探针1.1.放射性同位素标记物放射性同位素标记物n由于放射性同位素与相应的元素之间的化学性质完由于放射性同位素与相应的元素之间的化学性质完全相同，对碱基

12、配对的特异性和稳定性无影响。检全相同，对碱基配对的特异性和稳定性无影响。检测灵敏度和特异性也高于任何非放射性标记物，特测灵敏度和特异性也高于任何非放射性标记物，特别适用于单拷贝基因或低丰度别适用于单拷贝基因或低丰度mRNAmRNA检测，因此放射检测，因此放射性同位素虽然存在放射线污染、半衰期短、不能长性同位素虽然存在放射线污染、半衰期短、不能长期存放的缺点，但仍是目前应用最多的一类探针标期存放的缺点，但仍是目前应用最多的一类探针标记物。记物。(1)(1)生物素生物素n生物素生物素 生物素是一种小分子水溶性维生素，通过一条碳生物素是一种小分子水溶性维生素，通过一条碳链臂与链臂与UTPUTP或或d

13、UTPdUTP嘧啶环的第嘧啶环的第5 5位碳原子相连，对核苷酸进位碳原子相连，对核苷酸进行标记。行标记。n除除dUTPdUTP外，生物素标记的外，生物素标记的dATPdATP和和dCTPdCTP也已被研制和应用。也已被研制和应用。也可以将光敏基团与生物素的连接臂预先连接，形成光敏也可以将光敏基团与生物素的连接臂预先连接，形成光敏生物素，通过化学法对核酸探针进行标记。生物素，通过化学法对核酸探针进行标记。 (2) (2) 地高辛地高辛n地高辛（地高辛（digoxingenindigoxingenin，DigDig）又称异羟基洋地黄苷配）又称异羟基洋地黄苷配基，是一种具有半抗原性质的化合物。基，是

14、一种具有半抗原性质的化合物。n地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTPdUTP）上）上形成形成Dig-11-dUTPDig-11-dUTP。n与生物素相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性与生物素相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高，检测产物有鲜艳颜色，反生物素的干扰，敏感性高，检测产物有鲜艳颜色，反差好，背景染色低。差好，背景染色低。n不仅应用于不仅应用于SouthernSouthern印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交等，以检测特定基因序列，而且更普遍地应用于原位等，以检测特定基因序列，而且更普遍地应

15、用于原位杂交中。杂交中。 (3) (3) 酶酶n常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。针进行标记。荧光素荧光素荧光素标记的核苷酸结构荧光素标记的核苷酸结构荧光基团通过碳链臂连接到尿嘧啶核苷的荧光基团通过碳链臂连接到尿嘧啶核苷的5 5碳原子上，当被修饰的核苷碳原子上，当被修饰的核苷酸掺入到酸掺入到DNADNA分子中时，荧光素基团便将分子中时，荧光素基团便将DNADNA分子标记。右图是罗达明的分子标记。右图是罗达明的结构。结构。（二）（二） 核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法n根据标记物的不同分为放射性同位素标记和非放射性根据标记物的不同分为放射

16、性同位素标记和非放射性同位素标记。同位素标记。n放射性同位素标记中，裂变原子只是简单地掺入探放射性同位素标记中，裂变原子只是简单地掺入探针的天然结构而取代非放射性同系物。针的天然结构而取代非放射性同系物。n在非放射性同位素标记方法中，核酸中正常情况下在非放射性同位素标记方法中，核酸中正常情况下不存在的化学基团或复合物通过酶学、光化学或合不存在的化学基团或复合物通过酶学、光化学或合成反应与探针结合。当探针与靶核酸杂交后，探针成反应与探针结合。当探针与靶核酸杂交后，探针上的修饰基团可通过适当的指示系统而被检测。上的修饰基团可通过适当的指示系统而被检测。n根据反应方式不同可将核酸探针的标记方法根据反

17、应方式不同可将核酸探针的标记方法分为化学法和酶促法两种。分为化学法和酶促法两种。n化学法是利用标记物分子上的活性基团与核酸分子上的化学法是利用标记物分子上的活性基团与核酸分子上的基团（如磷酸基）发生化学反应而将标记物结合到探针基团（如磷酸基）发生化学反应而将标记物结合到探针分子上的方法，多用于非放射性同位素的标记，如光敏分子上的方法，多用于非放射性同位素的标记，如光敏生物素的标记、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等的标记。生物素的标记、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等的标记。这种方法的优点是简单、快速、标记均匀。这种方法的优点是简单、快速、标记均匀。n酶促法是将标记物（同位素或非同位素）预先标记在核酶促

18、法是将标记物（同位素或非同位素）预先标记在核苷酸分子上，然后通过酶促反应将标记核苷酸掺入到探苷酸分子上，然后通过酶促反应将标记核苷酸掺入到探针分子中，或将核苷酸分子上的标记物转移到探针分子针分子中，或将核苷酸分子上的标记物转移到探针分子上。上。 这种方法是目前实验室最常用的标记方法。这种方法是目前实验室最常用的标记方法。n核酸探针的酶促标记方法种类较多，如切口平核酸探针的酶促标记方法种类较多，如切口平移法、随机引物法、移法、随机引物法、cDNAcDNA探针的标记、探针的标记、DNADNA探探针的末端标记、针的末端标记、RNARNA探针以及寡核苷酸探针的探针以及寡核苷酸探针的标记等，可根据不同的

19、实验需要加以选择。标记等，可根据不同的实验需要加以选择。第三节第三节 核核酸分子杂交相关技术酸分子杂交相关技术 一、传统的核酸分子杂交技术一、传统的核酸分子杂交技术二、原位杂交二、原位杂交SouthernSouthern一、传统核酸分子杂交技术一、传统核酸分子杂交技术 分离开的分离开的DNA片段电转移至尼龙膜上片段电转移至尼龙膜上 Southern Southern 印迹杂交步骤示意图印迹杂交步骤示意图 标记探针与膜上标记探针与膜上DNA片段杂交片段杂交 显示与标记探针显示与标记探针杂交的杂交的DNA片段片段 图图9 91 1-2 -2 Southern Southern 印迹杂交步骤示意图印

20、迹杂交步骤示意图 2.Northern 2.Northern印迹杂交印迹杂交Northern Northern 杂交示意图杂交示意图 从细胞中提取从细胞中提取RNARNA，在变性条件下进在变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳。行琼脂糖凝胶电泳。EBEB染色后可见两染色后可见两条条rRNArRNA条带，另一条分子量小的条带，另一条分子量小的rRNArRNA在电泳过程中跑出凝胶，而在电泳过程中跑出凝胶，而mRNAmRNA由于由于含量低而不能显示条带。印迹杂交后含量低而不能显示条带。印迹杂交后可见条带。可见条带。 图图9-19-1 WesternWestern印迹流程图印迹流程图图图9-20 SDS-PAG

21、E 9-20 SDS-PAGE 与与Western blotWestern blot结果比较结果比较n由于免疫印迹具有由于免疫印迹具有SDS-PAGESDS-PAGE的高分辨力和固相的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，标本可长期保免疫测定的高特异性和敏感性，标本可长期保存，结果便于比较，故广泛应用于分子生物学存，结果便于比较，故广泛应用于分子生物学等领域的一种研究方法。等领域的一种研究方法。3. 3. 斑点杂交（斑点杂交（dot-blotdot-blot）与狭缝杂交）与狭缝杂交(slot blot)(slot blot)点杂交在疾病诊断中的应用：点杂交在疾病诊断中的应用：当基因的突变部

22、位和性质已完全明了时，根据已知的基因当基因的突变部位和性质已完全明了时，根据已知的基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，从而检测受检者基因是否发生突变，以及是否有新的突变从而检测受检者基因是否发生突变，以及是否有新的突变类型。这称

23、为类型。这称为等位基因特异性点杂交（等位基因特异性点杂交（Allele-specific Allele-specific oligonucleotideoligonucleotide，ASOASO）。ASOASO点杂交检测镰刀形细胞基因突变点杂交检测镰刀形细胞基因突变经典案例分析经典案例分析 镰刀状细胞贫血的基因突镰刀状细胞贫血的基因突变的检测变的检测镰刀状细胞贫血的基因突镰刀状细胞贫血的基因突变可以通过变可以通过ASOASO点杂交进点杂交进行检测。合成两种寡核苷行检测。合成两种寡核苷酸探针酸探针A-ASOA-ASO（正常（正常A-A-珠蛋白等位基因探针）珠蛋白等位基因探针）和和S-ASOS-ASO（镰刀状细胞（镰刀状细胞S-S-珠蛋白等位基因探珠蛋白等位基因探针），两种探针的长度都针），两种探针的长度都是是1919个核苷酸，序列为镰个核苷酸，序列为镰刀形细胞突变位点前后各刀形细胞突变位点前后各9 9个核苷酸（如图个核苷酸（如图9 92121）。）。 检测结果：用检测结果：用A-ASOA-ASO探探针检测，正常和杂合子个针检测，正常和杂合子个体标本呈阳性；用体标本呈阳性；用S-S-ASOASO探针检测，杂合子和探针检测，杂合子和纯合子个体标本呈阳性。纯合子个体标本呈阳性。二、核酸原位杂交二、核酸原位杂交n原位杂交是将核酸分