琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制ppt课件

1、LOGO由PowerBar模板组提供琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 LOGOPage 2n 学习动物的处死与组织匀浆的方法。学习动物的处死与组织匀浆的方法。n 学习离心机的运用方法。学习离心机的运用方法。n 进一步了解酶的竞争抑制原理。进一步了解酶的竞争抑制原理。实验目的：实验目的：LOGOPage 3实验原理：实验原理：n 竞争性抑制是指分子构造与底物类似的抑制剂可与底物竞竞争性抑制是指分子构造与底物类似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。抑

2、制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。n 草酸与琥珀酸的分子构造类似，是琥珀酸脱氢酶的竞争草酸与琥珀酸的分子构造类似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内，琥珀酸脱下的在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传送链传送，最后与氧经电子传送链传送，最后与氧结合生成水，并释放出能量。在体外那么可用甲烯蓝蓝结合生成水，并释放出能量。在体外那么可用甲烯蓝蓝色作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的色作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被复原而被复原为甲烯白无色。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色衰为甲烯白无色。在

3、甲烯兰含量一定的条件下，蓝色衰退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可根据退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可根据蓝色衰退时间来判别该酶活力被抑制的程度。蓝色衰退时间来判别该酶活力被抑制的程度。LOGOPage 4二、实验原理 抑制剂和底物的构造类似，可与底物竞抑制剂和底物的构造类似，可与底物竞争酶的活性中心，妨碍酶争酶的活性中心，妨碍酶-底物复合物的构底物复合物的构成。成。抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相对比例制剂与底物浓度的相对比例I/SI/SLOGOPage 5HOOCCH2CH2COOHHOOCCH=

4、CHCOOHFADFADH2MBH2MBH2甲烯白无色甲烯白无色MB甲烯蓝蓝色甲烯蓝蓝色在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判别琥珀酸脱氢在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判别琥珀酸脱氢酶活性的改动。酶活性的改动。草酸草酸HOOCCOOHHOOCCOOHn 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶LOGOPage 6实验器材与试剂实验器材与试剂: 一试剂一试剂pH=7.4的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液0.25%琥珀酸钠溶液琥珀酸钠溶液0.5%草酸钠溶液草酸钠溶液0.01%甲烯蓝溶液甲烯蓝溶液生理盐水生理盐水液体石蜡液体石蜡LOGOPage 7实验器材与试剂：实验器材与试剂：二器材二器材研钵研钵.手术剪手术剪.手术镊子手术

5、镊子2mL移液管移液管1000 uL微量可调仪器微量可调仪器10mL离心管离心管低速离心机低速离心机LOGOPage 8实验操作：实验操作：n (1)肝糜液的制备肝糜液的制备n 用颈椎脱臼法处死小白鼠用颈椎脱臼法处死小白鼠n 将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充分研磨至糊状分研磨至糊状n 分批参与磷酸缓冲液，边加边磨，总共分批参与磷酸缓冲液，边加边磨，总共7mln 搅匀后倒入圆底离心管，离心搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟分钟n 将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液酶的肝糜

6、液LOGOPage 9实验操作：实验操作：另取中试管另取中试管5支，标号支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定琥珀酸脱氢酶活力的测定编号编号123450.25%琥珀酸钠溶液/ml0.500.502.000.500.5%草酸钠溶液/ml0.500.500.502.00蒸馏水/ml2.002.001.50肝糜液/ml1.001.001.001.001.0甲烯蓝/ml0.200.200.200.200.20摇匀，静置于摇匀，静置于3737摄氏度的水浴中以后再勿摇动留意察看各管的颜色变化，记摄氏度的水浴中以后再勿摇动留意察看各管的颜色变化，记录各管颜色衰退的顺序和时间，分析缘由，振荡褪色的反响液，察看实验景

7、象并录各管颜色衰退的顺序和时间，分析缘由，振荡褪色的反响液，察看实验景象并分析产生该景象的缘由。分析产生该景象的缘由。LOGOPage 10n 1肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液里酶尽量释放到溶液里n 2离心时留意离心管一定要准确平衡，并将重要离心时留意离心管一定要准确平衡，并将重要相等的离心管对称放置相等的离心管对称放置n 3离心终了后拿取离心管时动作要轻柔，不要振离心终了后拿取离心管时动作要轻柔，不要振荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊本卷须知：本卷须知：LOGOPage 11思索题：思索题：n 1:

8、为什么反响开场后，反响液必需静止，不能在为什么反响开场后，反响液必需静止，不能在摇动摇动?n 防止空气中的氧接触反响溶液，使的复原性的甲防止空气中的氧接触反响溶液，使的复原性的甲烯白重新氧化成甲烯蓝烯白重新氧化成甲烯蓝LOGOPage 12思索题：思索题：n 2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本实验胜利的关键是什么？实验胜利的关键是什么？LOGOPage 13思索题：思索题：n 3：抑制剂还可以选用什么物质？：抑制剂还可以选用什么物质？n 还可以选用丙二酸还可以选用丙二酸n 4：利用本实验的数据，阐明酶竞争性抑制的特点：利用本实验的数据，阐明酶竞

9、争性抑制的特点？n 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反响产物竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反响产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位一样；位一样；c.抑制剂浓度越大，那么抑制造用越大抑制剂浓度越大，那么抑制造用越大；但添加底物浓度可使抑制程度减小；但添加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学动力学参数：参数：Km值增大，值增大，Vm值不变。值不变。LOGOPage 14思索题：思索题：n 5：本实验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺：本实验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺陷与改良方案？陷与改良方案？LOGOPage 15补充：补充：n 琥

10、珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶Succinatedehydrogenase，简，简称称SDH，黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是衔接氧化磷酸化与电子传送的枢属膜结合酶，是衔接氧化磷酸化与电子传送的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标志酶。志酶。n 琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受体的，另一种是作用于一切受体。体的，另一种是作用于一切受体。 LOGOPage 16n琥珀酸脱氢酶活力测定

11、方法目前主要有五种琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种 n1.硫酸甲酯吩嗪硫酸甲酯吩嗪PMS反响法反响法 n2.铁氰化钾铁氰化钾K3FeCN6复原法复原法 n3.TTC氯化三苯四氮唑法氯化三苯四氮唑法 n4.MTT法法 n5.NBT氯化硝基四氮唑蓝法氯化硝基四氮唑蓝法 LOGOPage 17n 1.硫酸甲酯吩嗪硫酸甲酯吩嗪PMS反响法反响法n 琥珀酸脱氢酶能经过一系列人工电子受体，如与琥珀酸脱氢酶能经过一系列人工电子受体，如与PMS吩嗪吩嗪二甲酯硫酸盐，二甲酯硫酸盐，DCPIP2，6-二氯酚靛酚等发生反响催二氯酚靛酚等发生反响催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，经过分光化琥珀酸的

12、氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，经过分光光度计检测即可加以定量反映，其反响式为：光度计检测即可加以定量反映，其反响式为：SuccinatePMSFumaratePMSH2；PMSH2DCPIPPMSDCPIPH2。DCPIP呈蓝色，规范的吸收光谱在呈蓝色，规范的吸收光谱在600nm处，这处，这种色泽可因其复原而渐次变淡，从而种色泽可因其复原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变处的光密度的变化与化与DCPIP含量成正比，测定含量成正比，测定2.6-DPIP的复原速度可以推算出的复原速度可以推算出SDH的活力。一分子的活力。一分子DCPIP被复原，即代表一分子琥珀酸被被复原，即代表一分子琥

13、珀酸被氧化。故可测定此反响系统在氧化。故可测定此反响系统在600nm处的吸收光度变化，来处的吸收光度变化，来计算计算SDH的活性。的活性。SDH活性计算：规范测定活性计算：规范测定/规范规范=mol/min/mg。 LOGOPage 18n 2.铁氰化钾铁氰化钾K3FeCN6复原法复原法 n 以铁氰化钾以铁氰化钾K3FeCN6和琥珀酸钠为底和琥珀酸钠为底物，使琥珀酸脱氢酶催化反响将铁氰化钾复原为物，使琥珀酸脱氢酶催化反响将铁氰化钾复原为亚铁氰化钾亚铁氰化钾K4FeCN6，K4FeCN6再与再与Fe3作用生成普鲁士蓝，在作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝之生成

14、量，作为琥珀酸脱光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱氢酶的复原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活氢酶的复原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。力愈强。 LOGOPage 19n 3.TTC氯化三苯四氮唑法氯化三苯四氮唑法 n 无色无色TTC2，3，5-氯化三苯基四唑作为氯化三苯基四唑作为人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，复原人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，复原成三苯基甲膳成三苯基甲膳TF。后者以红色晶体的方式存。后者以红色晶体的方式存在于细胞内，采用有机溶剂如甲苯、乙酸乙醋在于细胞内，采用有机溶剂如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等进展萃取。萃取液、三氯甲烷、丙酮或乙醇等

15、进展萃取。萃取液测定测定485nm吸光度后，以吸光度后，以TTC复原量表示脱氢酶复原量表示脱氢酶活性，根据规范曲线计算活性，根据规范曲线计算TF生成量，进而求出生成量，进而求出TTC-脱氢酶活性脱氢酶活性 LOGOPage 20n 4.MTT法法 n MTT是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶可以代谢复原琥珀酸脱氢酶可以代谢复原MTT，同时在细胞色，同时在细胞色素素C的作用下生成蓝色或蓝紫色不溶于水的的作用下生成蓝色或蓝紫色不溶于水的甲臜甲臜Formazana，经异丙醇作用颗粒溶解显，经异丙醇作用颗粒溶解显色。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正色

16、。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度比，因此可根据光密度570nm处处OD值推测出活值推测出活细胞的数目。细胞的数目。 LOGOPage 21n 5.NBT氯化硝基四氮唑蓝法氯化硝基四氮唑蓝法 n NBT易溶于水，呈淡黄色，以易溶于水，呈淡黄色，以NBT为受氢体为受氢体，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢，进而，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢，进而构成紫蓝色的沉淀，于反响体系中参与构成紫蓝色的沉淀，于反响体系中参与PMS，混，混匀，匀，37保温保温30min，之后参与，之后参与TCA终止反响。终止反响。加异丙醇溶解显色，混匀，即可于加异丙醇溶解显色，混匀，即可于54

17、8nm测测OD值。规定：值。规定：30min内内548nm下下OD值为值为1.0时的酶时的酶量为量为1个活力单位。比活力个活力单位。比活力=活力单位数活力单位数/毫克蛋白毫克蛋白。LOGOPage 22竞争性抑制的机理竞争性抑制的机理 n 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反响产竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反响产物；物；n 抑制剂与酶的结合部位活性中心与底物与抑制剂与酶的结合部位活性中心与底物与酶的结合部位一样；酶的结合部位一样；n 抑制剂浓度越大，那么抑制造用越大；但添加抑制剂浓度越大，那么抑制造用越大；但添加底物浓度可使抑制程度减小；底物浓度可使抑制程度减小；n 动力学参数：动力学参数：Km值增大，值增大，Vm值不变。抑制程值不变。抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例例n 留意：结合在酶的同一部位以及构造类似并留意：结合在酶的同一部位以及构造类似并不是竞争性抑制的必要条件，抑制剂结合的部位不是竞争性抑制的必要条件，抑制剂结合的部位妨碍底物和酶的结合，即产生空间位阻也可以呵妨碍底物和酶的结合，即产生空间位阻也可以呵斥竞争性抑制。斥竞争性抑制。 LOGOPage 23琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶n 琥珀酸脱氢酶是独一嵌入到线粒体内膜的酶，是琥珀酸脱氢酶是独一嵌入到线粒体内膜的酶，是线粒体内膜的一个重要部分，其它酶