木霉菌与植物病害的生物防治

1、木霉菌与植物病害的生物防治摘要：木霉菌是重要的植物病害防治菌，广泛分布于自然界。木霉菌具有广泛的适应性，能够杀伤多种重要的植物病原菌，作用机制多种多样。除了从自然界分离筛选之外，木霉菌的诱变育种改良技术，原生质体融合技术以及基因操作技术已有效地应用于木霉菌的改造。木霉菌的大量生产技术以及菌剂的制备技术也有较大发展，已经有10多种商品化制剂。木霉菌的筛选技术是需要重视的研究领域，而其发展则离不开对生态学和作用机制的详细了解。木霉菌具有广阔的研究与应用前景。关键词：木霉菌；植物病害；生物防治1前言木霉菌(Trichodermaspp.)属于半知菌类的丝抱纲，丛梗抱目，丛梗抱科，广泛存在于土壤、根围

2、、叶围、种子和球茎等生态环境中1932年，Weindling发现木素木霉(Trichodermalignorum)可以寄生于多种植物病原真菌，建议将该菌用于土传植物病害的生物防治，木霉菌生防研究工作从此开始。由于木霉菌的广泛适应性、广谱性及多机制性，一直是植病生防学家研究的重点对象。由于生物技术的发展，木霉菌已由单一地从自然界分离筛选达到有目的地利用生物技术进行改造以获得新型菌株的程度，如原生质体融合技术的引入已成功地研制出商品制剂F-Stop。截止到1997年，国内外已经登记的木霉菌制剂多达11种，其中包括哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)5个，多抱木霉菌(Trichod

3、ermapolysporum)1个，绿色木霉菌(Trichodermaviride)2个，其他木霉菌(Trichodermaspp.)3个，多数用于植物土壤传播病害的防治，如Sclerotinia,Phytophthora,Rhizoctonia,Pythium,Fusarium,Verticillium等。2木霉菌的分类由于木霉菌株的形态特征复杂，又缺乏稳定性，木霉菌的种类鉴定长期处于混乱状态。直到1939年，木霉菌的种类鉴定或是依据Gilman的工作，或是各行其事，没有统一的鉴定标准。1939年，Bisby检查了大量的木霉菌分离物，没有发现稳定的鉴别特征可供参考，因此主张木霉菌(Trich

4、oderma)是一个单种属(monotypicgenus。他的意见得到许多真菌学家的认可，此后相当长一段时间内，凡是产生绿色抱子的木霉菌都定为绿色木霉(Trichodermaviride)。然而木霉属是一个单种属的概念并未被Gilman接受。在1957年出版的Manualofsoilfungi»一书中，他仍把木霉属划分为4个种。1966年，Rifai和Webster发现Hypocrea的不同种产生相似的Trichoderma无性型，不是单种属，因此1969年他们依据对Hypocrea属的分生抱子阶段的研究，对木霉属的种类进行了修订，确定了9个集合种（speciesaggregate，

5、。从1984年至U1991年，Bissett在上述研究工作的基础上也对木霉属的分类进行了修订，除了Rifai确定的种以外，又追加了许多种，并将木霉属分为5个组。现将其分类结果列出如下：第一组：Hypocreanum组，包括T.lactea,也是该组的模式种。第二组：Longibrachiatum组，T.longibrachiatum是该组的模式种。另外的种是：T.citroviride,T.pseudokoningii和T.parceramosum第三组：Saturnisporum组，包括T.saturnisporum,也是该组的模式种。第四组：Pachybasium组，包括20个种，其中T.

6、hamatum是该组的模式种，另外19个种分另是：T.crassumT.croceum,T.fasciculatum,T.fertile,T.flavofuscumT.harzianum,T.longipilis,T.minutisporum,T.oblongisporum,T.piluliferum,T.polysporumT.pubescensT.spiraleT.strictipilisT.strigosumT.tomentosumT.yirensTrichodermaanam.ofHypocreasemiorbisandH.gelatinose.第五组：Trichoderma组，包括4

7、个种，其中T.viride是该组的模式种，另外3个种是T.aureoviride,T.koningii和T.atroviride。形态学是木霉菌分类的基础，最近的报道涉及分子生物学技术，例如将线粒体DNA以及质粒应用于木霉菌的分类研究，RAPD技术以及核型分析技术也用于木霉菌的分类研究，不过这类技术一般用来进行亚种或菌株的标记与鉴定。3木霉菌的特点3.1广谱性据报道，木霉菌对多种重要植物病原真菌有作用，如腐霉菌、轮枝菌、镰刀菌、长孺抱菌、交链抱菌、丝核菌、葡萄抱菌等。据不完全统计，木霉菌至少对18属，29种病原真菌表现拮抗活性。木霉菌的防治范围很广泛，主要是用于植物土传真菌病害的防治，有棉花枯

8、黄萎病、猝倒病、立枯病、小麦全蚀病、纹枯病、各种蔬菜的苗期病害等。在植物地上部病害生物防治研究中，木霉菌的应用也受到重视，如蔬菜病害的防治研究，我国已登记的一种木霉菌可湿性粉剂用于黄瓜和大白菜的霜霉病防治，另一种木霉菌可湿性粉剂（特立克,绿色木霉菌T.viride）则用于大棚蔬菜灰霉病及小麦等作物真菌性根病的防治，而田间实际应用表明，它还对黄瓜的霜霉病和白粉病有良好的效果。木霉菌也用于水果和蔬菜储藏期病害的防治，如对柑桔绿霉病。木霉菌对植物和人畜的安全系数很高，还没有发现药害和人畜中毒以及过敏事例，我们用大白鼠进行的绿色木霉菌急性经口毒性测定表明，LD50/kg至少在500g以上，因此实际是无

9、毒的。这些特性有利于同时防治多种植物病害，避开由于防治对象过于单一而造成将来的市场困难，以及因毒性带来的环境与人类健康问题。3.2广泛适应性木霉菌是土壤微生物区系的重要组成部分。在棉田中木霉菌的存在也很广泛，其群体密度在21002400cfu/g土。有人从中共分离到7个集合种，其中哈兹木霉、拟康氏木霉、长枝木霉是棉田中的优势种群。1986年Sivan自田间枯萎病棉株根际分离到35个哈兹木霉菌系，其中的一个菌系T-35可有效抑制棉花枯萎病菌。在温室试验中，将该菌系的泥炭糖蜜制剂（在1：1的糖蜜和泥炭混合基物上培养的T-35）施入土中，或制成分生抱子悬浮液进行拌种，可降低枯萎发病率。每公斤土中含哈

10、兹木霉分生抱子2M062X107时，可降低土壤枯萎病菌群体数量，抗生菌在土壤中可连续存活3年并可增殖。木霉菌对于一些杀菌剂如澳甲烷、五氯硝基苯、克菌丹、代森钮、瑞毒霉等有天然抗性，其生长及抱子萌发能适应较广的温湿度范围和pH范围。如绿色木霉可在pH47.5的培养基上快速生长。这一特性能保证木霉菌在土壤中保持一段时期的高种群水平，而不致于在短期内消失，有利于防病效果的发挥。3.3多机制性木霉菌的作用机制几乎包括了所有可能机制，并因此而受到广泛的关注，也是木霉菌用途广泛，效果突出的重要原因。据报道，木霉菌至少有如下几种作用机制：a.抗菌代谢产物的杀菌作用。抗菌代谢产物在目前的植病生防菌的筛选中是第

11、一位的重要指标，产生抗菌代谢产物与否及其产量大小往往决定着一个生防菌株的命运。木霉菌在产生抗菌物质方面具有优势，就其种类而言，仅抗真菌的代谢产物至少在70种以上。多数种类产生的抗生物质不止一种，如哈茨木霉可产生12种，康氏木霉可产生9种，绿色木霉可产生10种，钩状木霉可产生7种，长枝木霉可产生3种，多抱木霉可产生2种。这些抗生物质的化学性质各不相同，包括了戊酮、辛酮、类菇、多肽和氨基酸衍生物等几大类。由于抗生物质的种类，化学性质以及作用方式的差异，病原菌往往难以发展抗药性。b.重寄生作用。1932年，Wdindling即发现木霉可以寄生于R.solani,R.rolfsii,Phytophth

12、orasp,Pythiumsp和Rhizopuss当时注意到木霉菌丝可以沿寄主菌丝生长，或缠绕在寄主菌丝上生长，或穿入菌丝内部生长，从而导致寄主菌丝的死亡，木霉菌依靠寄主菌丝作为营养物质生长繁殖。目前已发现木霉菌至少可寄生18个属的29种植物病原真菌。c.溶菌作用。木霉菌有时不与寄主菌丝有直接接触，同样可以引起它们的解体。这与木霉菌的B-1,3-葡聚糖甘酶，几丁质酶和纤维素酶等有关。目前有的实验室已开始克隆B-1,3-葡聚糖甘酶和几丁质酶的编码基因，用于改造其他生防菌以获得新型高效菌株。d.毒性蛋白。1994年Lin等从一株绿色木霉中分离到一种蛋白质tricholin,是核糖体钝化蛋白，能抑制

13、R.solani生物与繁殖。研究表明，tricholin可导致R.solani的氨基酸吸收与蛋白质合成障碍，减少多聚核糖体的形成，从而减弱菌丝的生长。e.竞争作用。二硫化碳消毒土壤是防治Armillariamellea引起的植物根腐病的有效措施，一直以为是二硫化碳对病原菌的直接杀伤是主要原因。后来的分析表明，二硫化碳使土壤对木霉的抑制作用减弱，从而木霉菌大量繁殖，通过竞争与消解某些营养物质及产生毒性物质达到控制病害的目的。1989年，Sivan等对哈茨木霉的竞争作用进行了详细研究，通过添加葡萄糖和天门冬酰胺等试验，证明木霉菌的竞争在镰刀菌的防治中有重要作用。f.蛋白酶的作用。Elad等于199

14、9年发现蛋白酶活性与木霉菌防治蔬菜灰霉病(Botrytiscinerea)的能力有关，将蛋白酶与木霉菌的分生抱子混合可以提高防治效果，而蛋白酶的抑制剂则可以降低防治效果。3.4其它木霉菌的营养要求简单，生长速度快，对于将来的工业化生产十分有利。4木霉菌的筛选方法以平板上木霉菌对棉花枯萎病菌的抑制作用为主要的筛选标准和方法，包括重复寄生能力和抗生素产生的测定。一般采用平板对峙培养技术进行，这种方法所得到的结果往往与盆栽试验和大田应用试验的结果不一致，预见性较差。作者发现木霉菌的分生抱子可以为棉花产生的凝集素以及棉花病原菌(枯、黄萎病菌和立枯病菌)产生的凝集素所特异性凝集，两种凝集反应的程度分别与

15、木霉菌在棉花根际的定殖能力和木霉菌对病原菌的拮抗能力以至防治效果有关，可用来快速筛选有效的木霉菌菌株。但是，应当看到在菌株的筛选技术方面仍存在很多缺陷，导致筛选效率低下，不能获得有效的菌株。发现快速简便而又可靠的筛选技术势在必行，但是筛选技术的发展离不开对生态学和木霉菌作用机制的详细了解。5菌株改良技术由于筛选技术的缺陷或自然界中木霉菌本身的不足，难以得到理想的生防菌株，需要对菌株加以改良。目前的手段主要有诱变育种，原生质体融合以及转化。5.1诱变育种直到80年代，诱变育种技术才真正用于木霉菌。Papavizas等人19821983年以对苯菌灵的敏感性为标记，用紫外线对木霉菌进行了诱变，结果得

16、到了对苯菌灵等MBC类杀菌剂有抗性的菌株，从而用木霉菌和MBC类杀菌剂制成了复合制剂。采用同样的技术与原理，从哈茨木霉和绿色木霉中筛选到高抗MBC杀菌剂的变异株，这些变异株的生长特性、产抱能力、土壤存活能力以及抗菌能力(R.solani)同亲本菌株相比有明显改善。1984年，Papavizas得到一株苯菌灵抗性菌株T.virideT-1-R9,在美国农业部获专利登记，该菌株对菊花的镰刀菌枯萎病有良好效果。Ahmad和Baker(1987)用T.harzianum通过亚硝基月瓜诱变得到了苯菌灵抗性菌株，其中两株的纤维素酶产生能力明显高于野生型菌株，其根际定殖能力显著改善，他们推断纤维素酶活性的提

17、高与木霉菌根际定殖能力的强弱有相关性。5.2原生质体融合技术Harman等用哈茨木霉进行了原生质体融合试验，融合子的防病效果可与福美双比美。1993年，Harman等将哈茨木霉菌株T95的赖氨酸和组氨酸缺陷型株系融合，选出比亲本菌株拮抗谱广泛，根际定殖能力强，防病效果好的融合子，并以F-Stop为商品名进行了注明登记。木霉菌的原生质体融合技术应用还不多，但已是成熟的菌株改良技术，是值得重视的5.3转化木霉菌的遗传转化工作刚刚起步，还没有实质性进展，但有关的转化系统已经建立。1992年，Sivan等对含有不同启动子序列的几种质粒进行了转化绿色木霉和哈茨木霉的试验研究。这些质粒均含有HygB基因（

18、编码抗潮霉素B的基因）。PHIB质粒含有Cochliobolusheterostrophus的启动子序歹！J,获得的推断转化子最多。他们同时还对有关转化技术的细节如转化原生质体的再生等进行了详细探讨。1995年Green等利用GUS基因转化哈茨木霉菌用于生态学研究。1998年，Limon等利用amS基因以及木霉菌本身的几丁质酶基因chit33共转化哈茨木霉菌CECT2413得到了几丁质酶基因超量并结构表达的转化菌株，同野生型菌株相比，该菌株对Rhizoctoniasolani的抑菌活性明显提高。6制剂与加工总起来看，木霉菌的制剂与加工技术研究较少，木霉菌的大量培养技术尚处于模仿阶段，一般采用液

19、体或半固体生产方法，以得到大量的菌丝、厚垣抱子或分生抱子。基于活跃的菌丝比分生抱子更为有效的假设，Lewis和Papavizas发展了两种制剂与相应的加工技术。其中一种是，先将麦萩用水打湿，灭菌后接种木霉菌或绿色粘帚霉菌，培养23天（而非传统的23周），这种制剂可使生防菌在土壤中迅速生长，杀死或钝化土壤中的病原菌，试验证实，菌剂对于Sclerotiumrolfsii,Rhizoctoniasolani和Pythiumultimum弓I起的病害有良好的防治效果。在另一种方式中，含有麦萩的蛭石作为培养基使用，接种木霉菌后任其生长，然后予以干燥。这种菌剂至少可存放24周不失效，使用前，用稀酸稀释，培

20、养2天使菌丝呈现活跃生长状态，然后施于土壤中，对R.solani引起的甜菜和棉花立枯病有效，这种制剂的形式与加工方法的优点在于储存和活化过程不必保持无菌条件，但使用不方便，储存期短是其弱点。另外，也有人研究液体深层发酵生产木霉菌厚壁抱子的技术，但目前还不能获得大量的产物。有关木霉菌菌剂的载体也有一些研究工作，如萩皮等营养性物质，旨在刺激木霉菌在土壤中的增殖；有人研究了褐煤和釜储物作为木霉菌载体的可能性，将木霉菌褐煤和釜储物混合后接种木霉菌，风干制成颗粒，20c储存4个月后成活率在90%以上。还研究了几丁质作为添加物对木霉菌以及粘帚霉菌防治棉花枯萎病、黄萎病和立枯病效果的影响，发现在不同的生防菌

21、-病原菌组合中，几丁质对防治效果的影响不尽相同，有时反而会降低防治效果。其他剂型与加工技术也正在发展之中，有的取得成功，如以色列的Trichodex可湿性粉剂以及我国的1.5亿/克木霉菌可湿性粉剂，储存和使用都很方便。作者研制的木霉菌制剂特立克可湿性粉剂，用于防治大棚蔬菜灰霉病及小麦等作物的真菌性根部病害，于1997年由山东省民丰实业公司在农业部注册登记，采用液固两相法生产，制剂的分生抱子含量在2.0亿/克以上，较好地解决了储运和使用问题，可以喷雾防治植物地上部病害。7木霉菌防治植物病害的效果一般研究均肯定木霉菌的防治效果。以木霉菌防治棉花枯萎病和黄萎病为例。1972年，Panteleev用绿

22、色木霉菌处理棉花种子，可使黄萎病病株率从37.8%降至11.7%。1981年，Shadmanova用绿色木霉菌同时防治枯萎病和黄萎病获得成功。1986年，Sivan自田间枯萎病患病棉花植株的根际分离到35个哈茨木霉菌菌株，从中筛选到一个菌株T-35,可以有效地抑制棉花枯萎病菌。在温室试验中，将该菌株的泥炭糠制剂(在1：1的米糠和泥炭混合基物上的培养物)施入土壤中，或者制成分生抱子悬浮液进行拌种，可以降低枯萎病的发病率。每公斤土壤中含有哈茨木霉菌分生抱子达到2X106-2X107时，可以降低土壤中棉花枯萎病菌的群体数量，该抗生菌在土壤中可以连续存活3年并且可以增殖。Canapob(1984)在室

23、内和田间试验中，将棉花枯萎病菌的燕麦培养物和木霉菌的燕麦培养物同时施入病圃，木霉菌培养物的用量为120kg/hm2,或者使用工业制剂，用量分别为每公顷5、10和15kg,结果所试验的3个品种的枯萎病发病率在初期和6月底均比未处理的对照低14%16%,出苗率高8%10%,而且提高了籽棉的产量，具有良好的后效作用。Capbincakoba(1984,1985,1989)曾经将木霉菌的一个菌株与棉花枯萎病菌混合，病菌与拮抗菌的比例为1：10时效果最好；1：10和1：8两种处理，苗期以后的枯萎病发病率分别比对照减少了18%和24%,生长季后期分别减少了16%和22%,根际木霉菌占真菌总群体的30%50

24、%0用该菌株制成的木霉素生物制剂，活菌数为6M09/g,春季与腐熟的粪肥混合使用，每公顷用1520kg,第一年可以降低枯萎病的发病率达33%50%。真菌学研究表明，使用该制剂后，田间棉花植株上分离到的枯萎病菌比例为42.9%61.7%,未使用菌剂的棉花植株病菌的分离比例为77.5%82.5%;处理棉田的木霉菌数量从34片真叶期的2.2万上升到成熟期的4.04万，未处理区则只有0.71.5万。白俄罗斯曾经发展了大量生产木素木霉菌的技术，产品在4c下可以保存一年制剂的含抱量为7X10108X1010/g,防治棉花枯萎病时的用量为3040g/m2。因此，木霉菌防治棉花枯、黄萎病的效果是肯定的，但是防

25、治效果还处于很低的水平，所谓工业制剂的防治效果也没有超过50%,用量也特别大，实际上是一种菌肥，而不能称其为生物农药；例如木素木霉菌制剂的用量按每亩计算达到了20多公斤，并且制剂的性能也比较差，4c条件下仅能保存一年。在木霉菌防治其它病害的例子中也有类似的情况，但是多数商品化的制剂防治效果突出，比较稳定，都有一定的市场占有率，例如防治灰霉病的Tricho,Trichodex等。木霉菌也可以增加作物产量，例如Trichodermakoningii7a对小麦根部病害有效，但在病害发生较轻的情况下该菌仍可提高小麦产量。8木霉菌在植物病害生物防治中研究与应用的前景结合工业化生产需要，我们认为木霉菌生防菌株应具有如下特点：(1)生长速度快，产抱量大。这种特性适于工业化生产的要求。现行的木霉菌剂以收获分生抱子为主，产抱量大是获得大量培养物的必需条件。生长速度快，能缩短生产周期，降低生产成本。(2)作用谱广泛。防治对象过于单一是生物防治发展的一大障碍，工厂易于接受用途广泛的产品要求木霉菌的防治对象尽可能多。从另一角度来说，能同时防治多种土传病害也能减少防治其他病害的投入，容易为棉农所接受。例如，Lewis等1989年报道的一株木霉菌，只对茄丝核菌造成的棉花猝倒病有