浅谈PCR技术的发展

1、浅谈PCR技术的开展与创新历程姓名：娄旭学号：202118010015088单位：植物逆境生物学研究中央PCR又称聚合酶链式反响(PolymeraseChainReaction),是80年代中期开展起来的体外核酸扩增技术.它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断.PCR的问世,引起了一场分子生物学的革命,它大大加快了各种生物基因组结构研究的过程,有力地推动了现代生物学由细胞水平向分子水平、基因水平的开展,在分子生物学史上具有跨时代的意义.首先,我们来了解一下PCR

2、技术的根本原理.PCR技术是一种选择性体外扩增DNA片段的方法,其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的.所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡核甘酸.待扩增DNA模板加热变性后,两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性.在适宜的条件下,由DNA聚合酶催化引物介导的DNA合成,即引物的延伸.一个变性,退火,延伸的过程就是一个循环,PCR就是在适宜条件下这种循环的不断重复,每一循环所得到的产物又可作为下一循环的模板,以此类推,以后每一循环模板均比前一循环增加一倍,理论上讲,PCR扩增DNA产物是呈指数上升的.简单来说,PCR就是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点

3、,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程.接下来,我们来了解一下PCR技术产生白背景.20世纪70年代,遗传工程、重组DNA和克隆等科学技术进步产物的兴起,使生物技术产业炙手可热,它以效率和创造性为标志,为科学和商业提供了声望和商机,在科学进展与新产品开发和卫生保健行业开展直接挂钩的投资气氛下,分子生物学在美国蓬勃开展起来,也产生了孕育PCR技术的大环境：(1)重组工程和其他分子技术的重大突破；(2)具备了鼓励科研成果快速向应用问题转化的法规环境；(3)政府资助的研究与寻求投资的风险资本密切结合,为分子生物学的研究和开发奠定了雄厚的根底.由此,在对核酸研究

4、了将近100年后,人们开始致力于研究基因的体外别离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性,与适宜的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因.但由于当时很难进行测序和合成寡核甘酸引物,且当时Smith等发现了DNA限制性内切酶,使体外克隆基因成为可能,所以,使Khorana等的早期设想被人们遗忘.1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等创造了具有划时代意义的聚合酶链式反响：在试管中给DNA的体外合成提供以致一种适宜的条件-模板DNA,寡核甘酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时

5、间,并推出了第一台热循环PCR仪.Mullis也由此获得了1993年的诺贝尔化学奖.从最初技术设想的提出到目前各种PCR方法的应用,PCR技术在分子生物学中已经有了四十多年的历史,短短四十年中,PCR及其相关技术的开展速度是惊人的.国际上分别于1988年和1990年在美国和英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会.第一届会议主要讨论了PCR的应用与技术本身的优化问题；第二届会议的主要议题是人类基因组方案与PCR的最新进展.这充分表达了生物学家对PCR的重视.接下来,本人就PCR技术PCR技术的方法和手段,可以将其开展的开展历程和技术创新做简要的介绍.根据各阶段历程分为以下四个阶段.一初创期

6、Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,其缺点是：1引物链延伸反响在37c下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一.2Klenow酶不耐高温,90c会变性失活,每次循环都要重新加.此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每参加一次酶只能完成一个扩增反响周期,给PCR技术操作程序添了不少困难.这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视.1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR

7、,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段.但每循环一次,仍需参加新酶.技术创新过程：1988年Saiki等从美国黄石公园温泉中别离的一株水生嗜热杆菌thermusaquaticus中提取到一种耐热DNA聚合酶.此酶具有以下特点：1在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反响后再加新酶.2耐高温,在70c下反响2h后其残留活性大于原来的90%,在93c下反响2h后其残留活性是原来的60%,在95c下反响2h后其残留活性是原来的40%.3大大提升了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度2.0Kb.由于提升了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提升.为与大肠杆菌多聚酶IK

8、lenow片段区别,将此酶命名为TaqDNA多聚酶TaqDNAPolymerase,此酶的发现使PCR得到更为广泛的应用.二奠基期此阶段的PCR技术由于没有可以自动升降温的仪器装置而采用手动或机械操作,三个恒温水浴箱,分别恒定在三个温度：PCR的高温变性温度如94C,低温复性温度如58C,适温延伸温度如72C.再用一个装有PCR标本试管的提篮,用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴,标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时.这样PCR标本就能完成下述形式的热循环：94C30S,58C45S,72C60S,进行40次循环.这种方法的特点是：实验人员劳动强度大,容易因疲劳引起过失；而优点是：设备简单,投

9、资少,与自动化基因扩增仪相比,它无须升降温过程,实验时间短,试验更接近理想PCR反响条件,事实说明实验效果还是不错的,但由于标本试管从一个水浴箱往另一个水浴箱移动中要较短暂暴露于空气中,因此如移动速度不够快时也会对标本形成温度干扰,影响结果.本方法的另外一些缺点包括只能局限三个温阶某些PCR反响需要多于三个温阶、液体污染以及在低气压地区水温难以烧到94C变性温度等.创新过程：为改良提升本方法的自动化水平,有人设计了机械手装置,替代上述手工移动标本过程,形成了机械手水浴式基因扩增仪,该改良解决了实验人员的高强度劳动问题,但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障.这种类型的基因扩增

10、仪曾为我国的分子生物学的开展做出过积极奉献.(三)开展期此阶段的PCR技术是开展过程中的经典时期,是目前应用最为广泛最为普遍的PCR技术,之后开展起来的新技术都是在此根底上进行的扩展.在此阶段,具有代表性的就是自动化限制型定性基因的扩增仪即PCR仪的应用.PCR仪,也称DNA热循环仪、基因扩增仪.它的要求是要使体积不大的PCR反响液在尽可能短的时间内迅速实现变温,既要保证反响液到达要求的温度,又要使它迅速转换到下一温度,转换时间越短那么扩增的特异性越高.目前国内外使用做多的PCR仪的主要变温方式有变温铝块和变温气流式.创新过程：随着PCR技术的开展,PCR仪也在不断改良：用加热盖取代油封的加热

11、块型仪器,可预防在管盖上的冷凝作用,并能显著降卑微量管中样品内的温度梯度；反响加热块的构造和外形也在不断改良,加热盖在许多仪器上已经标准化,用于冷却的帕尔帖元件也更可靠；多种形式的载样系统不断出现,如微量管、微量滴定板、毛细管甚至载玻片都已用于PCR反响.与第二阶段的水浴式扩增仪相比,也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪,它是最具代表性的扩增仪,是后续各种扩增仪开展的根底.(四)成熟期PCR技术经历了各种创新与改良后在最近十来年成为一种成熟的分子生物学手段.它从一种定性的分析方法开展到定量测定；从原先只能扩增几个Kb的基因到目前已能扩增长达几十个Kb的DNA片段,PCR技术已越来越被人们所掌握.

12、到目前为止,PCR技术已有十几种之多,下面主要就免疫PCR、反向PCR、原位PCR和实时定量PCR来介绍PCR技术在这一阶段的开展及应用.(1)免疫PCR免疫PCR是一种抗原检测系统,将一段序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上,再用PCR方法将这段DNA扩增,然后用常规方法检测PCR产物.免疫PCR结合了免疫反响和PCR的特点,集PCR的高灵敏度与抗原抗体反响的特异性于一体.与常规PCR和普通ELAS相比,免疫PCR优势明显,其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度,能检测出浓度低至2ng/L的抗原物质,为现行任何一种免疫定量方法所不及.免疫PCR技术是常规PCR技术在医学免疫学领域

13、的主要扩展,它常被用于激素和细胞因子的检测、生化酶类的检测、治病微生物的检测、寄生虫感染的检测机其他毒素或蛋白的检测,因其检测效率高,在医学科研工作者中备受青睐.(2)反向PCR反向PCR又称为染色体缓移,可用于研究与DNA区段相连接的未知染色体序列,利用在序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切,在DNA连接酶的作用下自然形成环状DNA分子,然后利用方向适宜并与序列两端互补的引物,以连接成环的DNA为模板,这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补,但两引物3'端是相互反向的,经PCR扩增,得到序列上下游的旁侧DNA片段.反向PCR技术在检测病毒、转座子等在基因组中的整

14、合位点,建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件等方面优势明显.现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状DNA片段的杂交探针,这对于转座子插入序列确实定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要.与常规PCR相比,反向PCR优势突出,但它需要从许多酶中选择一种适宜的限制性内切酶进行酶切,另外,由于大多数真核基因组含有大量中度和高度重复序列,从而导致反向PCR得到的探针与多个基因序列杂交,影响扩增效果.(3)原位PCR与原位反转录PCR原位PCR技术是将PCR高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合,在组织细胞水平原位检测单拷贝的特定DNA或RNA序列.原位发转录PCR是指先将细胞核组织进行处理

15、以获得湿度的细胞通透性,再通过逆转录使mRNA转录成cDNA,然后把载玻片放入热循环机,对靶DNA等细胞内靶目标在原位进行PCR扩增,最后通过检测标记产物的方法检测扩增产物.原位PCR技术是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.它既能分辩鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.原位反转录PCR常被用于扩增和检测标本中罕见的mRNA,如定量细胞表达特殊mRNA的丰度.检测扩增产物的细胞起源及检测细胞群中基因表达的趋势等.(4)实时定量PCR实时PCR又称荧光定量PCR或TaqManPCR,是美国

16、PE公司(PerkinElmer)于1995年研制出的一种新的核酸定量技术.该技术在常规PCR根底上运用荧光能量传递(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技术,参加荧光标记探针,巧妙地把核算扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起,借助于荧光信号来检测PCR产物.一方面提升了灵敏度,另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线.在real-time技术的开展过程中,两个重要的发现起着关键的作用：在90年代早期,TaqDNA多聚酶的5'核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光记探针,因此使得间接的检测PCR产物成为可

17、能.此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反响管中能实时地监测反响全过程.这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化开展导致实时定量PCR方法在研究工作中的运用.PCR反响过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反响循环数的增加,最终PCR反响不再以指数方式生成模板,从而进入平台期.在传统的PCR中,常用凝胶电泳别离并用荧光染色来检测PCR反响的最终扩增产物,因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处.在实时荧光定量PCR中,对整个PCR反响扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反响时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线.在PCR反响早期,产生荧光

18、的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反响处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量.为了便于对所检测样本进行比拟,在实时荧光定量PCR反响的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值是以PCR反响的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍.如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义样本的域值循环数Ct.Ct值的含义是：每个反响管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.研究说明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线

19、性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小.利用起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数.实时荧光定量PCR的优势：设备由荧光定量系统和计算机组成,用来监测循环过程的荧光.与实时设备相连的计算机收集荧光数据.数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示.原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表.原始数据收集后可以开始分析.实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异.正常化后可以设定域值水平,这就是分析荧光数据的水平.样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值限制点的循环数.域值应设定在使指数期的扩增效率为最大,这样可以

20、获得最准确,可重复性的数据.如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品,线性回归分析将产生一条标准曲线,可以用来计算未知样品的浓度.实时荧光定量PCR要用定量PCR仪,目前常见的仪器有PE公司的PE系列,罗氏公司的Lightcycle系列,Robbett公司的RG系列.而根据荧光化学原理不同可分为DNA结合染色、TaqMan技术、Amplisensor、分子灯塔、复合探针法、杂交探针、自身淬灭技术等.目前,荧光定量PCR已被应用与病原体测定、免疫分析、肿瘤基因测定、基因表达、突变和多态性研究.除以上所介绍的四种新型PCR技术外,多重PCR,兼并引物PCR和重组PCR等其他的PCR技术均在各自的领域

21、发挥着重要的作用,小结从Mullis创造PCR技术我们可以看到：开发创造性思维的求异性关键在于一个思字.分子生物学处于生命科学中的前沿学科地位,这就决定了每个分子生物学工作者面对的是一条前人所没有走过的路,肩负着在荆棘丛生的知识荒野上开辟新路的重任.现有的书本和理论尽管一般说来是正确的,但毕竟只是对现阶段研究成果的总结,并非毫无纸漏可言,百分之百地绝对正确.迷信书本理论,有可能成为开发创造性思维的障碍.我们应该保持思维的开放性,既不受各种思维框框,如传统、权威、书本等束缚,又要善于吸收新的信息,容忍不同的见解,使自己的思维处于活泼、灵敏、兼容并蓄和实事求是的状态.而纵观PCR技术开展的这四十多年,每一次的飞跃都不开技术的创新和改革.Taq酶的发现从本质上突破了PCR技术开展的瓶颈,自动式PCR仪的出现更使PCR作为一种简便灵活易操作的技术而广为流行,而实时荧光定量PCR的应用更是使PCR