第8章发酵机制 51-100

1、l而糖酵解和三羧酸循环中间代谢物含量增高（见表4-3），可见，锰缺乏时黑曲霉的组成代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。 l当黑曲霉菌生长在缺锰的高浓度糖培养基中时，细胞内NH4+异常高（25mmol/L，随之出现几种氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨酸和-氨基丁酸）的积累和分泌，使NH4+对细胞的毒性被解除。l这些氨基酸的积累可能是由于蛋白质合成受干扰，从而导致蛋白质分解相应增加，细胞内蛋白质和核酸的减少所致。有锰离子存在时，添加环已酰亚胺（Cycloheximide）可以促进NH3+和氨基酸积累。 l由此可得到结论， NH3+积累是由于蛋白质和RNA转换过程中细胞蛋白质的再合成受损失伤引进

2、的，后者是由于Mn2+缺乏所致。虽然这过程中Mn2+的主要作用是什么仍不清楚，但在添加Mn2+后要经过几个时的延迟，并需要通过细胞质蛋白质（不是线粒体蛋白质）的合成才对柠檬酸发酵产生抑制效应。细胞质蛋白质的合成被环己酰亚胺所拮抗，而不被氯霉素拮抗。可以认为Mn2+的效应是通过NH3+水平升高而减少柠檬酸对PFK的抑制， NH3+水平升高是因Mn2+缺乏使蛋白质和核酸合成受阻。lMn2+对棒杆菌核苷酸积累的专一性影响和上述例子极为相似。关于核苷酸的积累，人们推断是因为催化核糖核苷酸形成聚合阶段第一步反应的酶需要锰。l某些真菌的丙酮酸是酵解过程第二个调节点已被证明，但是关于黑曲霉尚未被证明。用交换

3、定理未能确定这一步反应是否调节性。测定柠檬酸发酵时酵解中间代谢物浓度可推断流经丙酮酸激酶的通量增加。l丙酮酸是真菌糖代谢的一个重要分叉点，丙酮酸既可以由丙酮酸脱氢酶催化氧化脱羧生成乙酰-CoA，也可以由丙酮酸羧化催化经CO2固定生成草酰乙酸。lCO2固定的强度对柠檬酸高产率的一个重要条件。黑曲霉的丙酮酸羧化酶已被提纯，与其他真菌相反，此酶不被乙酰-CoA抑制，-酮戊二酸只有微弱的抑制作用，该酶的调节性很差。Feir（1969年）Johnson（1962年）、Wongchai（1974年）的研究指出此酶是组成型。 l二、三羧酸循环的调节l在许多细胞中三羧酸循环起始酶柠檬酸合成酶是一种调节酶。然而

4、根据柠檬酸合成与CO2固定之间的关系为化学计量关系，可以推断黑曲霉的柠檬酸合成酶没有调节作用。l从理论上推测，顺乌头酸水合酶失活，TCA循环阻断是积累柠檬酸的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2+。也有人报道，在积累柠檬酸时，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活。lLa. Naze等（1966年）比较了在不同产率的柠檬酸发酵中，顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶的活性，在柠檬酸产生和不产生时均存在。供给铜0.3mg/L，铁2mg/L ，和pH2.0情况下，这三种酶均不呈现活性。发酵中柠檬酸正是在这个酸度下积累的，因此他们认为细胞内pH2.0，上述三种酶失活是由于酸度太高造成的。但不能

5、解释为什么pH值会下降，即柠檬酸开始如何积累。l最近研究表明，黑曲霉中有一种单纯的，位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面平衡：l 柠 檬 酸 顺 乌 头 酸 异 柠 檬 酸=90 3 7 lTCA循环在柠檬酸积累中所起的作用可归纳为：l（1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键；l（2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱，而且这二个反应的平衡，保证了草酰乙酸的提供，增加柠檬酸合成能力；l（3）TCA循环的阻断或微弱（即顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶和-酮戊二酸脱氢酶活力降低），导致循环中间代谢物积累，由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定

6、水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。 l综上所述，柠檬酸的积累机制可归纳为：l由于锰离子缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH3+浓度升高和有一条不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对PFK的代谢调节，促进了EMP途径的畅通。由于丙酮酸羧化酶是组成型，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。由于顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：l柠檬酸 顺乌头酸 异柠檬酸=90 3 7l同时在控制Fe2+含量时，顺乌头酸水合酶活力低，使柠檬酸积累，一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑

7、制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累。柠檬酸的积累使pH值下降，在低pH值下降，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。l第七节 乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸l上述理论能够解释生成柠檬酸，而不能解释乙醇和醋酸或烃类发酵生成柠檬酸。l由于丙酮酸氧化脱羧反应是不可逆的。因此草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成。Olsen（1954年）证明黑曲每中存在异柠檬酸裂解酶，此酶催化异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸。有力地证明黑曲霉中存在乙醛酸循环。l由醋酸或乙醇或烃类合成柠檬酸的途径。见图4-5，从图可看出，在理论上3mol醋酸可以合成1mol柠檬酸，在此过程中没有

8、碳原子损失。由于合成柠檬酸的C4二羧酸只能由乙醛酸循环来提供，因此，柠檬酸向异柠檬酸的转化和后者的裂解是必不可少的。 l但理想的情况是柠檬酸转化的量应为生成量的1/2。这显然需要极为复杂的调节机制来控制，循环中的中间体都必须存在，使发酵产物中不仅仅是柠檬酸。l例如，酵母的烃类发酵产物中除柠檬酸外，含有较多的异柠檬酸，有时高达总酸的50%。现在已经清楚，酵母的烷烃发酵，柠檬酸的积累是在培养基中氮源耗尽以后开始的。在氮源耗尽时，细胞内AMP浓度陡然下降，这样抑制了NAD-异柠檬酸脱氢酶活性，这时柠檬酸的合成远大于分解，从而积累起来。后Mitsushima等人用线粒体实验支持了上述观点。l在酵母的柠

9、檬酸发酵中，异柠檬酸的积累量很高，但顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：l柠檬酸 异柠檬酸 顺乌头酸=90 7 3l对于这种现象，Marchal等（1980年）的解释是这几种三羧酸在细胞中存在于不同位点，柠檬酸完全存在于线粒体中，异柠檬酸在线粒体、细胞质和过氧化物酶体中均存在。由于细胞质中无顺乌头酸水合酶，异柠檬酸可以在此高度积累，因此异柠檬酸可以比顺乌头酸水合酶催化的平衡式高得多的比例分泌出体外。l柠檬酸的生产动态：l柠檬酸的发酵工艺：l柠檬酸应用：l正常代谢的微生物是不大量积累谷氨酸的，今天谷氨酸产生菌能够在体外积累100g/L以上谷氨酸，为菌体最大生长需要量0.3g/L的三百多倍。l在开始时曾

10、设想有新的合成途径的可能性，但其后的研究表明谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及发酵条件的适合。 l实验证明，谷氨酸产生菌的谷氨酸生物合成途径与一般微生物是一样的，没有特殊的途径，就是糖经过酵解途径（EMP）和单磷酸己糖途径（HMP）生成丙酮酸。一方面，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA；另一方面，经CO2固定作用生成草酰乙酸；两者合成柠檬酸进入三羧酸循环（TCA循环），由三羧酸循环的中间产物酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶催化下，还原氨基化合成谷氨酸。l图5-1为谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成途径示意图。可见谷氨酸的生物合成途径包括EMP、HMP、T

11、CA循环、乙醛酸循环（DCA）和CO2固定作用等。根据这一合成途径，由葡萄糖生成谷氨酸的总反应式为： l则1mol葡萄糖可以生成1mol谷氨酸，谷氨酸对糖的重量理论转化率为：%7 .81%100180147l但是，实际生产上由于菌体生长、副产物生成和生物合成的耗能等消耗部分糖，实际转化率低于81.7%。因此，必须合理地控制发酵，使糖最大限度地用于合成谷氨酸。 l一、EMP途径和HMP途径l大多数谷氨酸产生菌中存在这两个代谢途径。椎尾等（1960年）利用黄色短杆菌（Brev. flavum）.2247菌株进行研究，发现有EMP途径中的全部酶和HMP途径中的部分酶.l如己糖激酶、己糖磷酸异构酶、磷

12、酸己糖激酶、醇醛缩酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶等。l1961年苏等以扩展短杆菌（Brev. divaricatum）进行研究，同时发现与EMP途径、HMP途径有关的酶存在，证明了有这两个途径存在。 l图5-1 谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成途径 l关于EMP和HMP两个途径在糖酵解中所占比率，椎尾等以黄色短杆菌的完整细胞添加亚砷酸作为抑制剂，在通气条件下，由葡萄糖-6-14C和葡萄糖-尿苷酸-14C生成丙酮酸。结果得到EMP/HMP比率是90 10。l大石等（1965）在生物素充足和亚适量条件下对产氨短杆菌（Brev. ammoniagenes）进行研

13、究，由葡萄糖-1-14C及葡萄糖-6-14C放出14CO2回收率计算HMP的比率，结果表明，生物素充足菌HMP所占比率为38%，生物素亚适量菌为26%，并且添加亚砷酸抑制丙酮酸以后的代谢，而这两个值不变，他们的工作得出结论：生物素参与糖代谢的作用是增加糖代谢的速度。 l二、TCA、DCA和CO2固定作用l1. TCA循环l糖经过EMP、HMP途径生成丙酮酸，在有氧条件下，氧化脱羧生成乙酰-CoA，另一方面经CO2固定生成草酰乙酸，两者在柠檬酸合成酶催化下生成柠檬酸，进入TCA循环。l-酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸生物合成中是非常重要的。Shiio等曾测定谷氨酸产生菌中的-酮戊二酸脱氢酶，初期未被检出

14、，因而认为该酶缺失或活力极弱是谷氨酸产生菌的另一特征。但他们分析了谷氨酸发酵的实际转化率远低于理论转化率，可能是部分糖通过完整的TCA循环而被完全氧化。l经过深入研究，他们通过实验证明在黄色短杆菌中存在-酮戊二酸脱氢酶络合物，并发现该酶络合物极不稳定。该酶的活力很弱，使糖代谢流进入TCA循环后受阻在-酮戊二酸处，在有NH存在下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化生成谷氨酸。 l这一点也为木下等对TCA循环中有机酸的氧化能的研究结果所证实，如表5-2所示。柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸和-酮戊二酸的氧化能力几乎没有，即-酮戊二酸脱氢酶活性很弱。 l2. DCA循环l在谷氨发酵中，DCA循环一方面可以作为T

15、CA循环有缺陷时C4二羧酸的补充，特别是以醋酸和乙醇为原料的谷氨酸发酵，它是C4二羧酸的唯一补充来源，也作为能量供给来源的末端氧化系。l3. CO2固定l在谷氨酸发酵培养基中供给NaH14CO3时，可发现标记14CO2掺入到谷氨酸的-羧基，说明草酰乙酸的补充是通过CO2固定反应来完成的。在谷氨酸产生菌中已检出二种CO2固定反应酶：磷酸烯醇丙酮酸（PEP）羧化酶和苹果酸酶。l当黄色短杆菌以葡萄糖为唯一碳源时，葡萄糖生成的PEP分别经分解途径和CO2固定生成乙酰-CoA和草酰乙酸。PEP羧化酶对PEP的表现亲和力约是丙酮酸激酶的1/10，当PEP的浓度低时，PEP羧化酶不被乙酰-CoA和二磷酸果糖

16、激活，PEP容易进入分解途径；当乙酰-CoA浓度增加，与二磷酸果糖共同对PEP羧化酶激活，代谢转向CO2固定。另外，增加TCA循环的中间产物浓度，可认为与其保持平衡的天冬氨酸浓度增加，反馈抑制PEP羧化酶，代谢又转向分解途径，防止了草酰乙酸的过剩。 l当乙酰-CoA氧化，使ATP水平提高，结果丙酮酸激酶受ATP抑制，PEP又向CO2固定。当生物合成和需能反应使ATP浓度降低，则ATP对丙酮酸激酶的抑制被解除，此酶被AMP激活，使乙酰-CoA生成量增加。l因此，在谷氨酸合成中，糖的分解代谢途径与CO-2固定的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关键问题，有人选育丙酮酸脱氢酶活力低的菌株来提高谷氨酸产率

17、。 l三、氨的导入l谷氨酸发酵是氮素同化发酵。氨的导入是氨基酸发酵最基本的过程（如图所示）。从谷氨酸生物合成途径可知，氨的导入有三种方式：一是糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸；二是由天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给-酮戊二酸而生成；三是谷氨酸合成酶途径。但是谷氨酸产生菌中天冬氨酸酶和丙氨酸脱氢酶活力很低，转氨途径并不重要。 l谷氨酸产生菌的无细胞提取液在不供应外源NADPH+H+的条件下，可以将柠檬酸、乌头酸和异柠檬酸几乎完全转化为谷氨酸，但不能把-酮戊二酸转化为谷氨酸，这是因为需要NADP为辅酶的异柠檬酸脱氢酶和需要NADPH+H+为辅酶的谷氨酸脱氢酶形成了如上页图所示的

18、共轭反应：l异柠檬酸脱氢酶不仅催化-酮戊二酸的生成，提供了合成谷氨酸的前体物，并为催化-酮戊二酸还原氨基化的谷氨酸脱氢酶提供所必需的辅酶NADPH+H+。l在活细胞中，异柠檬酸脱氢酶活性总比谷氨酸脱氢酶低，所以NADP和NADPH+H+二者之中，NADP浓度是实际上的限速因子。l有人用实验证明添加氧化还原电位与NADP相似的氧化还原材料，并通以电流可促进还原氨基化作用，增加谷氨酸产量。 l在黄色短杆菌中，谷氨酸脱氢酶对-酮戊二酸和谷氨酸表现出同促相互作用，低浓度的-酮戊二酸和谷氨酸对此酶有显著的激活作用。l谷氨酸的生成反应被反应产物谷氨酸所抑制，而逆反应又被NH3和-酮戊二酸所抑制，不受其它T

19、CA循环中间产物和氨基酸的影响。l当谷氨酸浓度为100mmol/L时抑制酶活65%，浓度为400mmol/L时抑制90%，这比起其他反馈抑制要明显的弱，因而在谷氨酸发酵中从菌体内游离出来的谷氨酸浓度就显著的高，可以认为这个调节机制对谷氨酸生产发挥着很好的作用。l在谷氨酸发酵中，糖代谢除受生物素控制外，也受NH3的影响。使用生物素缺陷菌，在NH3存在下，葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸。l当NH3不存在时，糖的消耗速度很慢，生成物是-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。研究结果证明，在NH3存在下，葡萄糖消耗和氧吸收量比约为1，但NH3不存在时，比值一开始就为2，而且两种情况的呼吸商（RQ

20、）也不同。但是在生物素充足菌中，NH3几乎不影响糖代谢。l70年代初，在细菌中发现谷氨酸合成酶途径，反应如上图。虽然由这一途径合成谷氨酸需多耗费1分子ATP，但该酶的KM只有谷氨酸脱氢酶的1/10，即该酶对NH3的亲和力比谷氨酸脱氢酶强得多，当环境中NH浓度很低时，可由该途径合成谷氨酸。 l1975年Vandecasteele证实棒杆菌C91中存在NADP专一的谷氨酸合成酶，并发现以NH3为氮源时，谷氨酸脱氢酶活力高，以赖氨酸为氮源时，谷氨酸脱氢酶活力急剧下降，而谷氨酸合成酶活力提高，以后者催化合成谷氨酸。lVandecasteele认为谷氨酸发酵,细胞内的谷氨酸浓度较高，反馈抑制谷氨酸脱氢酶

21、活性（50mmol/L谷氨酸抑制酶活力50%），但不抑制谷氨酸合成酶，所以该酶在谷氨酸发酵中的作用值得重视。l第九节 细胞膜通透性控制l谷氨酸生物合成过程畅通和酶活性调节适当对谷氨酸发酵是很重要的，但是细胞膜对谷氨酸能透性似乎更为重要。l表5-3为黄色短杆菌.2247分别在生物素贫乏（3g/L）和生物素丰富（30g/L）的培养基中培养，然后分析培养基和菌体内氨基酸含量结果。l从表中可看出：在生物素贫乏培养基中积累大量谷氨酸，而在生物素丰富的培养基中几乎不积累谷氨酸；生物素贫乏的细胞内谷氨酸含量少，而且容易被洗出。有人分析了不产谷氨酸菌株和产谷氨酸突变株的无细胞抽提液酶活力，发现二者没有明显差别

22、。l在生物素丰富时，添加聚氧乙烯山梨糖醇杆棕榈酸酯等表面活性剂可以促进谷氨酸分泌。用溶菌酶消化细胞壁得到的类原生质体仍不能分泌谷氨酸，当在低渗溶液中胀破自溶才能排出谷氨酸。上述实验说明了谷氨酸的分泌是由细胞膜控制的。 l为了弄清细胞膜对谷氨酸分泌的控制机制，对嗜氨小杆菌细胞膜脂肪酸成分对谷氨酸的分泌影响进行研究，发现在糖质原料谷氨酸发酵中，加入聚氧乙烯山梨糖醇杆棕榈酸酯等饱和脂肪酸的表面活性剂，则这些表面活性剂的脂肪酸可在菌体内出现，使菌体的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸比率发生变化，饱和脂肪酸增加，l不饱和脂肪酸减少，当比率超过1时，有利于谷氨酸比率发生变化，饱和脂肪酸增加，不饱和脂肪酸减少，当比

23、率超过1时，有利于谷氨酸的分泌。不饱和脂肪酸以油酸为主，油酸对细胞膜的谷氨酸通透性不利，有碍谷氨酸排出体外。硫殖短杆菌体内油酸含量与体外谷氨酸积累的关系如图5-2所示。l图5-2 硫殖短杆菌体内油酸量和体外谷氨酸生成量l 利用甘油缺陷型菌株以正十六烷生产谷氨酸时，发现在积累谷氨酸的细胞内油酸或不饱和脂肪酸总最比不积累谷氨酸的细胞多，这与糖或醋酸原料生产谷氨酸时细胞内油酸或不饱和脂肪酸少于饱和脂肪酸刚好相反，说明了谷氨酸的通透性并非都是受不饱和脂肪酸含量控制。l后来使用薄板层析和柱层析法测定了细胞膜的类脂成分含量，阐明了细胞外积累谷氨酸和细胞膜类脂肪酸酯高于糖蜜培养基中，积累了大量谷氨酸时，发现在中性类脂中饱和脂肪酸增加，而磷脂和不饱和脂肪酸减少。 l许多研究指出了细胞膜的谷氨酸通透性受细胞膜的磷脂含量控制，如表5-4所示。至于不饱和脂肪酸对谷氨酸分泌的影响，也是由于不饱和脂肪酸减少而导致磷脂含量减少。细菌和细胞的谷氨酸减少而导致磷含量减少。细菌细胞的谷氨酸排出控制机制如图5-3所示。 l第十节 菌种选育模型与控制方法 l谷氨酸的分泌受细胞膜控制，而影响细胞膜的谷氨酸通透性主要是细胞膜的磷脂含量。因此，提高细胞膜的谷氨酸通透性，必须从控制磷的合成着手或