流式细胞仪结果分析PPT学习教案

1、会计学1流式细胞仪结果流式细胞仪结果(ji gu)分析分析第一页，共71页。流式细胞术流式细胞术(flow cytometry, FCM)(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段是以流式细胞仪为检测手段(shudun)(shudun)的一项能快速、精确的对单个细胞理化特的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。性进行多参数定量分析和分选的新技术。 流式细胞术流式细胞术第1页/共71页第二页，共71页。 流式细胞流式细胞(xbo)(xbo)术最大的特点是能在保持术最大的特点是能在保持细胞细胞(xbo)(xbo)及细胞及细胞(xbo)(xbo

2、)器或微粒的结构及器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞从分子水平上获取多种信号对细胞(xbo)(xbo)进行进行定量分析或纯化分选。定量分析或纯化分选。 特点特点(tdin)(tdin)：检测速度快、检测通量高、单细胞多：检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测参数的检测流式细胞术的特点流式细胞术的特点(tdin)第2页/共71页第三页，共71页。流式流式细胞仪仪(y y)流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪第3页/共71页第四页，共71页。样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓，样本来源：各种细胞（如外周血

3、，骨髓，实体组织实体组织(zzh)(zzh)、悬浮或贴壁培养的细、悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等。胞），微生物，人工合成微球等。检测大小：一般是检测大小：一般是0.5um0.5um40um40um流式细胞仪可以流式细胞仪可以(ky)做做什么？什么？第4页/共71页第五页，共71页。液流系统液流系统(xtng)(xtng)光学系统光学系统(xtng)(xtng)数据处理系统数据处理系统(xtng)(xtng) 分析分析(fnx)(fnx)型流式细胞仪型流式细胞仪分选系统分选系统(xtng)(xtng)分选型流式细胞仪分选型流式细胞仪流式细胞仪的组成流式细胞仪的组成第5页/共71页

4、第六页，共71页。（1）液流 液流系统液流系统(xtng)流动流动(lidng)室室流动室（流动室（Flow cellFlow cell）是液流系统的核心部件，流动室是由石）是液流系统的核心部件，流动室是由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕通过流动室英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕通过流动室内一定孔径的孔，检测区在该孔的中心内一定孔径的孔，检测区在该孔的中心(zhngxn)(zhngxn)，细胞在此，细胞在此与激光垂直相交。与激光垂直相交。第6页/共71页第七页，共71页。层流层流(cn li)(cn li)水力水力聚焦技术聚焦技术第7页/共71页第八页，共71页。光学

5、系统光学系统Light scattering at Light scattering at FSCFSC represents the particle size and represents the particle size and areaareaLight scattering at SSC depends Light scattering at SSC depends on granularity and complexity on granularity and complexity of the particleof the particle第8页/共71页第九页，共71页。n光

6、电倍增管：光电倍增管：FS, SSFS, SS（散射（散射光），光）， FL1, FL2, FL3, FL1, FL2, FL3, FL4FL4（荧光）（荧光）光学系统光学系统第9页/共71页第十页，共71页。FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图第10页/共71页第十一页，共71页。（3）数据处理系统第11页/共71页第十二页，共71页。基本工作基本工作(gngzu)原理原理第12页/共71页第十三页，共71页。单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘

7、液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本基本(jbn)过程过程第13页/共71页第十四页，共71页。 细胞在液柱中与激光束相交时细胞在液柱中与激光束相交时向周围向周围360立体角方向散射的光立体角方向散射的光线信号，它的强弱线信号，它的强弱(qin ru)与细与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定(cdng)第14页/共71页第十五页，共71页。第15页/共

8、71页第十六页，共71页。第16页/共71页第十七页，共71页。FALS SensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图第17页/共71页第十八页，共71页。侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号(xn ho)，用于检测细胞内部结构属性。第18页/共71页第十九页，共71页。FALS Sensor90LS SensorLaser侧向侧向(c xin)散射光示意图散射光示意图第19页/共71页第二十页，共71页。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别光

9、散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别(jinbi)(jinbi)出出某些亚群某些亚群 第20页/共71页第二十一页，共71页。三、荧光三、荧光(ynggung)测量测量第21页/共71页第二十二页，共71页。激发激发(jf)(jf)波长波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)第22页/共71页第二十三页，共71页。第23页/共71页第二十四页，共71页。荧光荧光(ynggung)补偿补偿第24页/共71页第二十五页，共71页。 通过流式细胞仪进行通过流式细胞仪进行(jnxng)细细胞分选主要是在对具有某种特征的胞分选主要是在对具有某

10、种特征的细胞需进一步培养和研究时进行细胞需进一步培养和研究时进行(jnxng)的。的。四、细胞四、细胞(xbo)分选原理分选原理第25页/共71页第二十六页，共71页。细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集偏转落入收集器器压电晶体压电晶体(jngt)产生产生(chnshng)机械振动机械振动不充电不充电(chng din)充电充电（一）分选基本原理（一）分选基本原理第26页/共71页第二十七页，共71页。n分选得率：从一群体细胞悬液分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再中分辨

11、出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。得率。与分选速度成反比。（二）分选的技术（二）分选的技术(jsh)要求要求第27页/共71页第二十八页，共71页。第二节第二节 数据数据(shj)(shj)的显示与分析的显示与分析第28页/共71页第二十九页，共71页。一、一、 参数参数(cnsh)第29页/共71页第三十页，共71页。n直分析直分析(fnx)(fnx)方图方图设门分析设门分析(fnx):REGION(fnx):REGION和和GATEGATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式第30页/共71页第三十一页，共71页。（一）单参

12、数（一）单参数(cnsh)直方图直方图第31页/共71页第三十二页，共71页。单参数单参数(cnsh)直方图直方图细胞相对数量细胞相对数量信道信道(channel(channel ) )第32页/共71页第三十三页，共71页。用颗粒密度反映同样散射光或用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。荧光强度的颗粒数量的多少。（二）双参数（二）双参数(cnsh)直方图直方图第33页/共71页第三十四页，共71页。1.双参数双参数(cnsh)直方图点图直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红色荧光强度红色荧光强度第34页/共71页第三十五页，共71页。双参数双参数(cnsh)直方图点图直方图点图第

13、35页/共71页第三十六页，共71页。2. 二维等高图二维等高图第36页/共71页第三十七页，共71页。二维等高图二维等高图第37页/共71页第三十八页，共71页。3. 假三维等高图假三维等高图第38页/共71页第三十九页，共71页。（三）三参数（三）三参数(cnsh)直方图直方图第39页/共71页第四十页，共71页。（四）流式细胞仪的多参数（四）流式细胞仪的多参数(cnsh)分分析析第40页/共71页第四十一页，共71页。根据根据(gnj)(gnj)门的形状又分为了线性门、矩形门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。门。 三

14、、设门分析三、设门分析(fnx)技术技术第41页/共71页第四十二页，共71页。A A 淋巴细胞淋巴细胞B B 单核细胞单核细胞C C 中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒粒细胞细胞A A、B B、C C均为均为任意任意(rny)(rny)门门第42页/共71页第四十三页，共71页。线性门线性门第43页/共71页第四十四页，共71页。第44页/共71页第四十五页，共71页。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字如十字(sh z)(sh z)门分门分析时，起就可以由四析时，起就可以由四个区域构成，即个区域构成，即G=D

15、1+D2+D3+D4G=D1+D2+D3+D4。 第45页/共71页第四十六页，共71页。第46页/共71页第四十七页，共71页。单细胞悬液单细胞悬液一、免疫检测样品一、免疫检测样品(yngpn)制备制备第47页/共71页第四十八页，共71页。第48页/共71页第四十九页，共71页。二、常用的荧光染料与标记二、常用的荧光染料与标记(bioj)染色染色第49页/共71页第五十页，共71页。FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光(jgu(jgung)ng)细胞细胞(xbo)(xbo)悬液悬液异硫氰

16、酸荧光异硫氰酸荧光(ynggung)(ynggung)素素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类（一）几种常见的荧光染料（一）几种常见的荧光染料第50页/共71页第五十一页，共71页。名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋

17、白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用常用(chn yn)的几类荧光染料的几类荧光染料第51页/共71页第五十二页，共71页。能量传递能量传递(chund)复合染料复合染料第52页/共71页第五十三页，共71页。PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色(hng

18、s)荧光花青花青(hu (hu qn)qn)苷苷5 5藻红蛋藻红蛋白白(dnbi)(dnbi)能量传递复合染料机制能量传递复合染料机制第53页/共71页第五十四页，共71页。（二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记(bioj)第54页/共71页第五十五页，共71页。三、免疫胶乳三、免疫胶乳(jior)颗粒技术的应用颗粒技术的应用第55页/共71页第五十六页，共71页。微小的乳胶微球分别微小的乳胶微球分别(fnbi)(fnbi)染成上百种不同的荧光色（固染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜

19、色来编码）而液相芯片则是用颜色来编码）第56页/共71页第五十七页，共71页。第57页/共71页第五十八页，共71页。通过对标记不同荧光通过对标记不同荧光(ynggung)(ynggung)素分子素分子的检测，实现的检测，实现FCMFCM对可溶性物质的定量分对可溶性物质的定量分析析第58页/共71页第五十九页，共71页。（一）单细胞悬液制备（一）单细胞悬液制备(zhbi)(zhbi)的的质控质控第59页/共71页第六十页，共71页。（二）免疫荧光染色（二）免疫荧光染色(rns)(rns)的质控的质控第60页/共71页第六十一页，共71页。n绝对计数校准绝对计数校准: : 保证计数的保证计数的准

20、确性。准确性。（三）仪器（三）仪器(yq)(yq)操作的质控操作的质控第61页/共71页第六十二页，共71页。（四）免疫检测的质控（四）免疫检测的质控第62页/共71页第六十三页，共71页。第63页/共71页第六十四页，共71页。一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析(fnx)(fnx)第64页/共71页第六十五页，共71页。三、淋巴造血系统三、淋巴造血系统(xtng)及白血病免疫及白血病免疫分型分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留留(cnli)(cnli)病变病变第65

21、页/共71页第六十六页，共71页。CD4+Th细胞细胞(xbo)、CD4+/CD8+比例比例MDR(+)MDR(+)表示表示(biosh)(biosh)对化疗药物耐药对化疗药物耐药五、五、AIDS病检测中的应用病检测中的应用第66页/共71页第六十七页，共71页。HLA-B27可出现可出现(chxin)在在58%97%的的强直性脊椎炎强直性脊椎炎(As) 患者患者第67页/共71页第六十八页，共71页。群体反应性抗体群体反应性抗体(kngt)(kngt)（Panel reactive antibody, Panel reactive antibody, PRAPRA）检测。）检测。第68页/共71页第六十九页，共71页。思考题1.流式细胞仪的分析检测原理是什么？2.流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。3.何谓荧光补偿？何谓“液相芯片”技术？4.细胞分选的基本原理。5