SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量ppt课件

1、v学习学习SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。测定蛋白质分子量的原理。v 掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。v运用运用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴测定蛋白质分子量及染色鉴定。定。 CH2=CHC=ONH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CHCH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )mvSDS-PAGE SDS-

2、PAGE 是在蛋白质样品中参与是在蛋白质样品中参与SDSSDS和含有巯基乙醇的和含有巯基乙醇的样品处置液，样品处置液，SDSSDS是一种很强的阴离子外表活性剂，它是一种很强的阴离子外表活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级构造。级和三级构造。 蛋白质分子结合蛋白质分子结合SDSSDS阴离子后，所带负电荷的量远远超阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差别。蛋白质的电泳迁移率主要决议于亚基带净电荷的差别。蛋白质的电泳迁移

3、率主要决议于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 SDSSDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的MWMW。v将知分子量的规范蛋白质在将知分子量的规范蛋白质在SDS-PAGE SDS-PAGE 中的电泳迁移中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条规范曲线。只率对分子量的对数作图，即可得到一条规范曲线。只需测

4、得未知分子量的蛋白质在一样条件下的电泳迁移需测得未知分子量的蛋白质在一样条件下的电泳迁移率，就能根据规范曲线求得其分子量。率，就能根据规范曲线求得其分子量。v当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在17,00017,000165,000165,000之间时，之间时， 蛋蛋白质白质-SDS-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：数呈线性关系： v lgMW = K - bmlgMW = K - bmv Staking gelSeparating gel 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相衔接，将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相衔接，翻开电泳仪开关，设

5、置电压为翻开电泳仪开关，设置电压为110V110V，电泳，电泳80mins,80mins,此时溴酚蓝染料到达凝胶底部，停顿电此时溴酚蓝染料到达凝胶底部，停顿电泳，封锁电源。泳，封锁电源。 用移液器分别取用移液器分别取10 l样品液，小心将样品加到凝样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。胶凹形样品槽底部。 量出加样端距细铜丝间的间隔量出加样端距细铜丝间的间隔(cm)(cm)以及各蛋白质样品以及各蛋白质样品区带中心与加样端的间隔区带中心与加样端的间隔(cm)(cm)，按下式计算相对迁移率，按下式计算相对迁移率mRmR： 相对迁移率相对迁移率mR=mR=蛋白质样品迁移间隔蛋白质样品迁移间隔(cm)(cm)溴酚蓝区带距加样端间隔溴酚蓝区带距加样端间隔(cm)(cm)1、在上样缓冲液中、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴、巯基乙醇、甘油及溴酚兰的作用分别是什么？酚兰的作用分别是什么？2、在、在S