细胞生物学技术ppt课件

1、第第2章章 细胞生物学技术细胞生物学技术2.1 细胞形状构造的察看方法细胞形状构造的察看方法2.1.1 光学显微镜技术光学显微镜技术显微镜和显微镜的分辨才干显微镜和显微镜的分辨才干肉眼：肉眼：0.2 mm; 光镜：光镜：0.2 m; 电镜：电镜：0.2 nm0.61 分辨率分辨率 DN . sin / 2=: 光源波长光源波长; : 物镜镜口角物镜镜口角; N: 介质折射率介质折射率显微镜成像原理显微镜成像原理普通复式光学显微镜普通复式光学显微镜light microscope双目显微镜双目显微镜正置显微镜正置显微镜倒置显微镜倒置显微镜相差显微镜相差显微镜phase-contrast micr

2、oscope光程差或相位差转变为振幅差，相差板光程差或相位差转变为振幅差，相差板微分干涉显微镜微分干涉显微镜differential-interference microscope厚度差转变为明暗差；添加样品反差，立体感强厚度差转变为明暗差；添加样品反差，立体感强荧光显微镜荧光显微镜fluorescence microscope荧光显微镜及其照片荧光显微镜及其照片黏着斑蛋白黏着斑蛋白细胞骨架细胞骨架激光共聚焦原理激光共聚焦原理激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜laser scanning confocal microscope激光共聚焦显微镜及其显微图像激光共聚焦显微镜及其显微图像黏着斑蛋白黏着

3、斑蛋白细胞骨架应力纤维细胞骨架应力纤维共定位分析共定位分析暗视野成像原理暗视野成像原理显微镜的暗视野功能显微镜的暗视野功能(A)明视野显微术；明视野显微术；(B)相差显微术；相差显微术；(C)微分干涉显微术；微分干涉显微术；(D)暗视野显微术暗视野显微术荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术fluorescence recovery after photobleaching, FRAP荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术fluorescence resonance energy transfer, FRET1电镜根本知识和构造波长小于电镜根本知识和构造波长小于0.1nm2样品制备样品制备 超薄切

4、片，负染色，冰冻蚀刻，三维重构，扫描超薄切片，负染色，冰冻蚀刻，三维重构，扫描3电镜种类电镜种类 扫描电子显微镜扫描电子显微镜 透射电子显微镜透射电子显微镜 扫描隧道显微镜和原子力显微镜扫描隧道显微镜和原子力显微镜2.1.2 电子显微镜技术电子显微镜技术透射电镜及其图像透射电镜及其图像透射电镜照片透射电镜照片免疫电镜照片免疫电镜照片扫描电镜及其图像扫描电镜及其图像扫描电镜照片扫描电镜照片冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻电镜技术照片冰冻蚀刻电镜技术照片负染色电镜技术照片负染色电镜技术照片2.2.1 高速、超速和梯度密度离心分别各种细胞器、生物高速、超速和梯度密度离心分别各种细胞器、生物 大分子及

5、其复合物大分子及其复合物2.2 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法差速离心差速离心密度梯度离心密度梯度离心差速离心过程差速离心过程2.2.2 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类的显色细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类的显色DNA：福尔根：福尔根Feulgen反响紫红色反响紫红色多糖类：多糖类：PAS反响黄色反响黄色脂肪：苏丹脂肪：苏丹III红色红色蛋白质：米伦蛋白质：米伦Millon红色红色2.2.3 特异抗原的定性与定位特异抗原的定性与定位免疫荧光免疫荧光免疫电镜免疫电镜免疫沉淀免疫沉淀Western blotting2.2.5 特异核酸标志技术特异核酸标志技术In situ hybrid

6、izationNorthern blot (RNA); Southern blot (DNA)2.2.4 放射性标志生物大分子的合成和动态放射性标志生物大分子的合成和动态3HDNA合成合成35S蛋白质合成蛋白质合成14C碳水化合物合成碳水化合物合成32P核酸合成核酸合成定性、定位、半定量研讨标志，自显影定性、定位、半定量研讨标志，自显影32P14天天, 14C5760年年, 3H12年年, 35S87天天, 131I 8原位杂交技术原位杂交技术2.2.6 定量细胞化学技术定量细胞化学技术2.2.7 细胞内大分子的分别与分析细胞内大分子的分别与分析 柱层析、分子筛、免疫吸附、免疫沉淀等方法分别柱

7、层析、分子筛、免疫吸附、免疫沉淀等方法分别 蛋白质组分及复合物交联和变性蛋白质组分及复合物交联和变性显微分光光度术显微分光光度术 紫外显微分光光度仪、可见光显微分光光度染色紫外显微分光光度仪、可见光显微分光光度染色流式细胞仪流式细胞仪蛋白质电泳分析蛋白质电泳分析流式细胞术流式细胞术2.3 细胞培育、细胞工程与显微操作技术细胞培育、细胞工程与显微操作技术2.3.1 细胞培育细胞培育 1植物细胞植物细胞 单倍体细胞培育，原生质体培育，体细胞培单倍体细胞培育，原生质体培育，体细胞培育育 2动物细胞动物细胞 原代细胞培育，永生细胞系原代细胞培育，永生细胞系 3非细胞体系非细胞体系 DNA复制，复制，R

8、NA转录，蛋白质合成，高尔基转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡体的膜泡 运输，细胞核装配等运输，细胞核装配等 细胞提取物，细胞核提取物细胞提取物，细胞核提取物植物组织培育植物组织培育动物细胞培育动物细胞培育细胞的克隆细胞的克隆2.3.2 细胞工程细胞工程 1细胞交融与杂交细胞交融与杂交 植物细胞先去壁；植物细胞先去壁； 交融方式：仙台病毒或聚乙二醇介导，电交融方式：仙台病毒或聚乙二醇介导，电交融等交融等 同核交融细胞，异核交融细胞，染色体丧同核交融细胞，异核交融细胞，染色体丧失失 2单克隆抗体技术单克隆抗体技术2.3.3 显微操作技术显微操作技术1975年英国科学家年英国科学家Milstein

9、and Kohler, 1984年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖B淋巴细胞淋巴细胞 + 小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤转移细胞核、细胞器、基因等转移细胞核、细胞器、基因等2.3.4 转基因、基因沉默、基因敲除、方式生物等转基因、基因沉默、基因敲除、方式生物等转基因技术转基因技术显微操作仪显微操作仪显微操作表示图显微操作表示图Mario Capecchi (Late 1980s) (University of Utah)embryonic stem cells in inner cell mass as target cells1/104 cells undergo a process of homologous

10、 recombination. 基因敲除技术基因敲除技术2.4 细胞生物学研讨的方式生物细胞生物学研讨的方式生物病毒转基因载体病毒转基因载体细菌大肠杆菌作为基因工程菌株细菌大肠杆菌作为基因工程菌株酵母真核表达载体，基因功能分析酵母真核表达载体，基因功能分析线虫线虫1000个左右细胞构成个左右细胞构成黏菌同步化资料黏菌同步化资料蛙卵细胞大，易操作蛙卵细胞大，易操作果蝇遗传背景清楚，表型易掌握果蝇遗传背景清楚，表型易掌握斑马鱼胚胎发育研讨的好资料斑马鱼胚胎发育研讨的好资料小鼠与人更接近小鼠与人更接近学生报告标题：学生报告标题： 1，转基因技术及其运用；，转基因技术及其运用； 2，细胞工程技术在消费实际中的运用；，细胞工程技术在消费实际中的运用； 3，基因敲除技术及其运用；，基因敲除技术及其运用； 4，方式生物线虫及其在细胞生物学研讨中，方式生物线虫及其在细胞生物学研讨中的运用；的运用； 5，方式生物斑马鱼及其在细胞生物学研讨，方式生物斑马鱼及其在细胞生物学研讨中的运用；中的运用； 按学号分组，按组确定标题，每个组确定按学号分组，按组确定标题，每个组确定一名组长并委派一个报告人。每个组除提交一名组长并委派一个报告人。每个组除提