核磁共振波谱技术

1、核磁共振波谱技术Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy 在结构生物学研究中的应用在结构生物学研究中的应用 现代分子生物学现代分子生物学现代分子生物学序n 随着人类基因组计划初步研究结果的发表，基因组测序工作已经接近尾声, 生命科学正进入一个崭新的时代, 即“后基因组时代”, 此时, 研究的重点变为解读人类30 亿个碱基对排列顺序所代表的含义, 这其中的一个重要问题是要研究它们的表达产物蛋白质的结构和功能, 结构基因组学（或者叫做基于结构的功能基因组学）应运而生了.n结构基因组学是解决全部基因组产物(包括蛋白质和RNA , 鉴于目前进展, 主要

2、指蛋白质)的三维结构的新兴前沿学科, 它综合运用生物信息学、基因工程、X 射线晶体学和核磁共振(NMR)波谱学等的知识, 在实测有限蛋白质结构的基础上, 通过结构预测阐明基因组中全部蛋白质的三维结构, 从此三维结构出发, 寻找蛋白质的功能线索. 随着若干个初步研究计划的顺利实施, 由美、日等9 个国家的科研机构组成的“国际结构基因组学科学联合研究体”也已经成立, 这标志着以多学科、高通量、新技术、高速度为特征的结构基因组学研究已进入了崭新的阶段. 结构基因组学的研究目标结构基因组学的研究目标 n截至2001 年2 月, PDB(Protein Data Bank) 发布的蛋白质三维结构为114

3、万, 它们分别属于一千多个蛋白质家族；n而已知的三维结构蛋白质在整体中只占很少的一部分. 如何快速、大量获得这些基因组蛋白质的三维结构、功能的信息, 是摆在人们面前的重要任务？n利用已知的同源蛋白质三维结构数据, 由结构预测方法对未知结构蛋白质进行建模, 给出较为精确的结果, 是大规模获得三维结构的捷径. 当未知结构蛋白质与已知结构蛋白质的序列相似性超过30 %时, 由结构预测方法建立的蛋白质三维结构模型已可以用于一般性的功能分析，这样, 有选择地实验测定1万-2万个靶蛋白质的结构,就可以为所有蛋白质提供同源建模的模板。 结构基因组学研究现状结构基因组学研究现状 n1998 1999 年期间,

4、 美国国立卫生研究院(NIH) 召开了三次有关蛋白质结构初步行动的研讨会. 资助的七个结构基因组学研究中心于2000 年9 月正式运作, 参加者主要是根据地区的不同来划分。每个研究中心至少由5 个研究所组成. 中西部结构基因组中心和东南结构基因组协作组计划从大量不同种类的生物体中挑选新折叠类的靶蛋白质; 东北部和纽约两个结构基因组联合体以及结构基因组联合中心重点研究具有重要生理功能的蛋白质家族;柏克利结构基因组中心计划确定生殖器支原体的蛋白质折叠 .预计在未来几年内, 这些研究中心不但可以运用X 射线晶体学和NMR 方法测定几百个新蛋白质的结构, 还能开发出基因表达、蛋白质纯化、结晶、以及蛋白

5、质结构测定和分析的新方法 。n日本的RIKEN 结构基因组初步行动开始于1995 年, 当时主要目标是研究功能域的拓扑结构类型, 即折叠类, 后来转变为对嗜热栖热菌中蛋白质家族的结构研究, 预期每年将要确定50100 个三维结构. 此外, 日本的生物信息研究中心(BIRC) 将重点研究膜蛋白的结构n.欧洲的结构基因组学研究主要集中在高通量结构分析所必需的技术、方法上. n目前结构基因组学研究的最大障碍是缺乏必要的协调, 这也是大部分制药公司仍在观望的原因之一. 如何使研究交叉最小化而合作最大化, 是决定结构基因组学研究发展的重要因素.结构基因组学的研究内容结构基因组学的研究内容 n从技术角度讲

6、, 结构基因组学研究大体可分为实验部分和运算部分。n实验部分的工作主要包括: 大规模的基因克隆、表达, 表达产物的纯化、结晶, X 射线衍射或NMR 波谱数据收集. n运算工作主要包括: 基因组分析、靶蛋白(家族) 的选择、衍射或波谱数据的处理、结构解析以及最后的结构与功能分析。基因组分析和靶蛋白选择克隆、表达和纯化NMR数据收集结晶NMR数据处理 X射线衍射解析结构、提交到PDB结构分析和功能分析结构基因组学的主要流程靶蛋白质的选择靶蛋白质的选择 n靶蛋白的选择是结构基因组学研究的核心问题, 与传统方法有很大不同, 它主要通过对数据库的搜索, 采用逐步筛选的方法进行. n在选择靶蛋白时, 应

7、在覆盖整个基因组范围的前提下使靶蛋白的数量尽可能少, 这样可以使实验测定工作更有效,更有代表性. 靶蛋白的选择主要通过三个层次的筛选：生物领域的选择、蛋白质家族的选择和蛋白质的选择.n结构基因组学研究中选择的靶蛋白的序列应覆盖整个蛋白质序列空间, 也就是说, 可为每个蛋白质家族提供至少一个实验测定的三维结构, 用于整个蛋白质家族的结构建模 。根据推测,一个独立的结构数据可以提供1540 个蛋白质的同源建模 。n在研究领域确定后, 要排除那些已知结构和能被同源建模的蛋白质家族, 包括正在被其他小组研究的蛋白质. 还要排除那些不适合高通量大规模结构基因组学研究的蛋白质家族, 主要是排除那些不适合X

8、 射线衍射和NMR 研究的蛋白质家族, 一般是指那些具有跨膜螺旋序列或者是具有较多低复杂度区域的蛋白质家族. 有些研究组还排除那些有翻译后修饰的蛋白质家族.在确定所要研究的蛋白质家族后, 从蛋白质家族中挑选出一个适合结构研究的蛋白质或蛋白质结构域作为靶蛋白. 主要的根据是蛋白质的大小、热稳定性、等电点等性质。 基因的表达与纯化基因的表达与纯化 n目前最常用的是大肠杆菌表达体系,。n一般载体上有T7 启动子. 为了自动化分离的需要, 还要在重组蛋白的N 端或C 端加上亲和标签, 比如poly2His , GST2tag 等. 亲和标签的引入可以大大减少纯化步骤, 在NMR 结构测定中, 较小的标

9、签(如poly2His) 不必切掉. 据估计, 用这样的方法,15 %20 %的小蛋白质(不含膜蛋白) 可以在大肠杆菌中以可溶形式表达, 且能很好地分离纯化. n对于原核基因有约三分之一到二分之一的并不能很好地表达出适合结晶或NMR 研究的, 具有足够含量和纯度的蛋白质. n对于真核基因, 这个比例会更高. 此时可以筛选溶解性最好的直系同源基因, 还可以更换表达体系, 或只表达一个结构域。nEdwards 等建立了一个数据库, 用来研究蛋白质的表达情况、结晶可能性与序列之间的关系。蛋白质的结构测定和结构预测蛋白质的结构测定和结构预测 nX射线衍射和NMR 是蛋白质结构测定的两大互补方法, 在进

10、行三维结构测定之前, 要使用质谱、圆二色、一维NMR、光散射等手段评估样品是否适合三维结构测定. n NMR 在结构测定中是X 射线方法的重要补充, 虽然NMR 研究对蛋白质样品要求较为严格, 但是据初步估计, 仍然至少有25 %的酵母ORF 适合于NMR 进行结构研究。n大部分蛋白质的三维结构可以通过建模来确定, 目前建立蛋白质结构模型的方法有三种: 从头计算( ab initio )法、比较建模( comparativemodeling) 法和折叠识别(fold recognition) 法。 结构测定方法比较n在生物大分子结构确定方面，X-射线晶体学和核磁共振（NMR）波谱学是两种主要的

11、方法。nX-射线晶体学在处理能力、精确度、蛋白质大小限制等方面仍然具有优势，也许在确定每个蛋白的花费上也有优势。n然而，核磁共振具有其独特的能力，它可以得到多个时间尺度范围内蛋白质内部运动的动力学信息，以及其与配体结合的性质。人们越来越清楚的认识到，蛋白质的运动与其功能有着密不可分的关系。有的运动只是对结构的微小修正，而有的则至关重要。由肽的结合而引起的钙调蛋白的结构变化以及由肽键断裂引起的丝氨酸蛋白酶抑制物的结构改变是最具重要意义的例子。在寻找蛋白质与配体的结合位点时，化学位移微扰是一个常用的方法。核磁共振方法还有可能用来确定难于结晶的膜蛋白的结构。n到今年10月8日为止，PDB总共收集了1

12、8,881个由实验得到的三维结构，其中的2929个结构是由核磁共振方法所得。考虑到核磁共振研究生物大分子的历史较短，这样的成绩已经是很可观的。基因组蛋白质的功能分析基因组蛋白质的功能分析n蛋白质的功能是由其特定的空间结构所决定,而蛋白质的空间结构的保守性又远大于序列的保守性, 因此在没有同源序列的时候, 三维结构将可为蛋白质功能的推测提供大量的信息. n蛋白质的功能至少有三种类型: 表型功能、细胞功能和分子功能, 而由三维结构揭示的功能一般是指分子水平上的功能或生化功能. n目前存在三种不同的功能分析类型: 由折叠同源性推测功能; 由结构特性推断功能; 由结构建模推断功能, n不同类型的结构分

13、析将提供不同分辨率水平的功能信息 . Shapiro 等在研究中发现蛋白质AdipoQ/ Acrp30 的结构与TNF 家族细胞因子的结构相似, 因此推测它的功能与细胞因子相近. Zarembinski 等从高分辨晶体结构发现靶蛋白出人意料地和ATP 分子结合,因此他们推断这个靶蛋白具有ATP 酶的活力, 生化实验最终证实了他们的推测.结构基因组学中的结构基因组学中的NMR-NMR-国际动向国际动向n国际上已有许多结构基因组研究中心致力于NMR 在结构基因组研究中的应用. n美国东北研究中心计划要解决NMR 数据的自动分析;n而东南研究中心要解决NMR 结构测定的自动化, 目的是要使NMR 方

14、法适应结构基因组高通量、大规模的结构分析要求;n加拿大多伦多大学组织了结构基因组前沿课题, 他们将同位素标记的热自养甲烷杆菌( Methanobacterium thermoautot rophicum ) 基因组编码蛋白质分到几个NMR 小组, 同时进行数据收集和结构分析. 最终在一年内得到了十几个三维结构;n欧洲也已开始着手对高通量NMR 结构分析计划提供研究基金;n日本的横滨RIKEN 中心拥有一个庞大的NMR 实验室. 在实验室中总共安装10台600 MHz , 6 台800 MHz 和4 台900 MHz 的NMR 高场谱仪. 在2002 年全部安装完毕后, 其NMR 的结构测定数将

15、大体相当于X 射线的测定数.结构基因组研究中结构基因组研究中NMR的特点的特点 nNMR 在结构基因组研究中是一个关键方法,它的优势体现在：nNMR 研究不需要蛋白质结晶, 而在基因组中有许多蛋白质不能结晶,或者其结晶不能提供很好的衍射图; nNMR在接近生理条件的溶液中进行实验, 溶液条件稍有不同就会调制蛋白质结构功能关系, 因此可以在不同溶液条件下进行实验, 获取有关蛋白质结构与功能的关系; n简单的一维同核NMR 实验, 或者相对较容易的二维异核(1H-15N HSQC) 实验可直观地提供蛋白质折叠程度(foldedness) 的信息;nNMR 方法所指认的各原子基团的化学位移包含了许多

16、蛋白质功能特征的信息; n蛋白质骨架原子核化学位移可以相当正确地确定蛋白质二级结构单元, 形成这些二级结构单元的氨基酸片段, 对三级结构预测提供了有效的数据; n在结构基因组学中, 基于结构预测功能的一个重要方面是对下游作用的表征. nNMR 波谱中化学位移变化可证实预期的功能, 可以筛选配体小分子, 扫描配体结合的抗原决定簇.结构基因组学研究对结构基因组学研究对NMR技术的要求技术的要求 n要求蛋白质的分子质量不能太大(最大在25 30 ku) ；n在水溶液中蛋白质要稳定, 不降解, 不聚合, 高溶解度. 在蛋白质表达中, 要求高效表达（毫克级）,n要求进行同位素标记：在常用的大肠杆菌表达体

17、系基础上, 基于已经成熟的13C、15N、2H 同位素标记方法；运用无细胞表达体系以及细胞系表达体系制备蛋白质样品；近年开展的在稀释液晶类溶剂中蛋白质残余偶极耦合的研究, 更是提供了蛋白质肽键空间取向的信息, 强化了NMR 方法在结构测定中的功能. n期望在不久的将来, 可自动化分析NMR 复杂的大量的数据, 那时NMR 必将在结构基因组研究中作出更多更重要的贡献.引言 核磁共振波谱Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy学是一门年轻而发展极为迅速的科学。在短短40年中它大致经历了四个阶段：n1945-1951年是发明核磁共振法并奠定理论和实验

18、基础的时期（于1946年Purcell和他的同事们在哈佛大学报道了在粗石蜡中的核磁共振吸收。同年稍后Block 和其同事们在斯坦福大学报道了液体水中核磁共振现象。为此他们在1952年同时获得诺贝尔奖）；n1951年-1960年前后，是连续波核磁共振（CW-NMR）波谱大发展的时期；除物理学家外，NMR技术的巨大作用已开始为化学家和生物学家所公认，他们用1H,19F,31P-NMR技术解决了许多重要的科学难题；n1965年前后，NMR进入到第三个阶段，这就是脉冲 Fourier变换NMR技术的兴起（PFT-NMR）；这是NMR技术一次革命性的飞跃，它不仅大大提高了NMR的灵敏度和分辨率，而且实现

19、了常规测定天然丰度极为稀少的13C核；这一时期发展起来了双频和多频共振技术；n从70年代后期起，随着电子计算机技术的发展和超导磁体NMR谱仪的出现，使NMR这门技术的应用范围迅速扩大到生物医学领域；n新近又出现了生物分子NMR技术。 n2002年瑞士的库尔特因用NMR研究活细胞环境下蛋白质的结构获诺奖。生物分子NMRn第一个生物分子的NMR谱发表于1957年，用的是40MHz的谱仪，所提供的信息是多肽和蛋白质的氨基酸组成。n近年来核磁共振技术无论在仪器的性能还是在实验方法都有了巨大的进步： 随着600和800MHz超导高场谱仪的应用，NMR技术的灵敏度和分辨率都有了很大的提高。随着选择和多重选

20、择激励技术、接力和反向等间接检测技术和梯度场技术等的出现，采用多脉冲进行多重磁化迁移，检测多种量子相干的二维、三维乃至四维NMR实验方法的出现。特别是随着近年来生物工程技术的发展，N15和C13同位素标记蛋白质的制备成为可能，利用它们等核种的杂核三维和四维等新颖技术能够克服信号重叠、简并和线形变宽等障碍，把可归属的蛋白质分子量扩展到25KDa左右。 生物NMR技术的发展要归功于共振信号序列归属策略的发展。共振信号的归属是生物NMR技术中最基本的也是最重要的步骤。 NMR在生物学中的作用n如今2D 和3D-NMR方法已提供了相当数量的小蛋白质（包括大蛋白的独立板快）、寡核苷酸 、寡糖的三维结构；

21、nNMR能提供非常有价值的有关局部结构、构象动力学方面的信息；nNMR技术还可以用来表征电荷状态、构象、与配位体结合的解离速度、研究蛋白质卷曲与折叠；n把结构和动力学信息相结合的能力也许是生物NMR技术在结构生物学方面最为重要的贡献；nNMR技术还可用于鉴定蛋白质分子中某些与配体分子中某些原子间的相互接触，研究大分子之间以及它们与小分子之间相互作用和分子识别。如蛋白质与DNA酶与底物或抑制剂，抗原与抗体，核酸与转译因子，蛋白质与肢质体，药物分子与受体等的分子间相互作用；n当前NMR技术的应用范围仍在不断地拓展。目前的现状是：一方面生物大分子的结构研究促进了NMR技术进步；另一方面后者又反过来大

22、大推动了结构生物学的发展。 NMR基本概念n核磁共振是指核磁矩不为零的核（I0)，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频（radio frequency, RF）辐射的物理过程。即原子核在磁场中吸收一定频率的无线电波而发生核自旋能级跃迁现象 。n要点： 1）I0 2） H0 3) E=h (共振吸收)NMR的基本原理n原子核的自旋运动 原子核具有一定的质量和一定的体积，可以把它看成是一个接近球形的固体。实验表明，大多数的原子核如同陀螺一样，都围绕着某个轴作自旋运动。例如，常见的 H11和C136(6是质子数即原子序数，也是电荷数

23、；13是质量数=质子数+中子数)核等都具有这种运动。原子核的自身旋转运动称为核的自旋运动。一般用“自旋矩”、“自旋动量矩”或“自旋角动量”来描述这种自旋运动 。无自旋运动的核 有自旋运动的核 陀螺的自旋运动原子核的自旋角动量 进行自旋运动的原子核都具有一定的自旋角动量。核的自旋角动量是个矢量，用P表示，它的方向与旋转轴相重合。根据量子力学计算，原子核自旋角动量的绝对值由下式决定： P= h/2 I(I+1)= hI(I+1) h为普朗克常数=6.62410-27尔格秒 h=h/2 I核自旋量子数，I=0、1/2、1、3/2。 由上式可见，核自旋角动量的大小决定于核自旋量子数I。它表示某种原子核

24、所固有的特性，不同的原子核有不同的I值。它只能取零，半整数，整数。是不连续的，故为量子数。实验证明：n I=0 原子核的质子数与中子数都为偶数，则它的质量数也为偶数。这种核的自旋量子数I等于零。即核的自旋角动量为零，不产生核磁信号。如；C126、O168、S3216、Se8034；n I=1 原子核的质子数与中子数都为奇数，它的质量数为偶数，则I是整数（1、2）这类核有自旋现象，如：H21、N147等。n I=1/2 原子核的质子数和中子数其中有一个是奇数，它的质量数为奇数，则I是半整数（1/2、3/2、5/2、），这类核是核磁共振研究的主要对象，如：H11、C136、F199、N157、P3

25、115等。 原子核的磁矩和电四极矩 原子核带有一定的正电荷，粗略地讲，可以认为这些电荷均匀地分布在原子核的表面上。I0的核没有自旋运动。I0的原子核有自旋运动，故这些电荷也围绕着旋转轴旋转，从而产生一个循环电流。有循环电流就会产生一个磁场，这就如同电流流过线圈时产生磁场一样。即凡是自旋不为零的原子核都会产生一个磁场，也就是说它们像一个小磁铁一样具有磁性质。一般是用磁矩来描述这种性质。核磁矩的大小取决于核的自旋量子数I及磁旋比，即 = Ih/2 有一些原子核中的电荷分布是球形对称的，但大多数原子核中的电荷分布不是球对称的。一般用原子核的电四极矩来度量核中电荷分布离开球形对称的程度。核中电荷分布的

26、情况接近于旋转椭球体的形状。用QN表示核的电四极矩，它的公式为：QN2/5Ze(b2-a2 ) 式中b 和a为椭球体的两个半径；Ze为核的电荷。 I=0 QN=0 I=1/2 QN=0 I1 QN0 I 1 QN0ZZZ核磁共振条件-量子力学观点 由前所述，自旋角动量不等于零的原子核都具有自旋磁矩。如果把这个核放到静磁场中，那么磁场对核磁矩有一个作用力，使磁矩在磁场中具有一定的能量。核磁矩在静磁场中的能量决定于核磁矩在静磁场方向上的投影与磁场强度乘积的负值。 E=-E=-z zH H0 0 z =gNNM ( M=I、I-1、-I) g-兰德因子 M电子的轨道磁量子数 即核磁子在z轴上的投影是

27、一些不连续的数值，这表示核磁矩在空间的方向不是连续变化的，而只能取某几个固定的方向。这就叫核磁矩的空间量子化。将两式合并得 E=-gNNMH0 当把电磁波作用到原子核系统上，这个电磁波的频率所决定的能量的量子h，正好等于原子核两个相邻的磁能级之间的能量差额（EM1-EM）时这个电磁波就会引起原子核在这两个能级之间的跃迁。从而引起原子核对电磁波的吸收或者辐射。我们可以通过观察原子核对电磁波的吸收现象来观察这种共振跃迁。这就是核磁共振现象。得核磁共振条件是： h=gh=gN NN NH H0 0 h普朗克常数；电磁波的频率 核磁共振条件-经典力学观点 H0n原子核如同陀螺一样作自旋运动，故具有自旋

28、角动量。n具有自旋角动量的核同时也具有磁矩。n如果把核放在静磁场当中，磁场对磁矩有一个作用力，使核磁矩围绕磁场方向进行转动，从而描绘出一个圆锥形轨迹。这就是原子核在静磁场中的进动。n原子核进动的速度用角速度或角频率来描述，它与磁场强度成正比。其关系可用Larmor方程说明：0=/2H0 磁旋比(核磁矩与核角动量的比值) 或 0=H0 n当发生核磁共振时，照射无线电频率必须等于原子核的进动频率 =0 =0 n在外磁场中若使核发生自旋能级跃迁，所吸收的光子能量h=E于是=/2H0 =H0 即为核磁共振条件，亦为核磁共振基本公式。n上式表明，共振频率与磁场强度成线性关系，这一结论与量子力学得出的结论

29、一致。 Z NMR技术常用的参数 n化学位移：把由于原子和分子中核的化学环境不等价而引起拉摩尔进动频率的变化叫做化学位移。用表示，单位为ppm。n自旋自旋偶合：由于分子内部原子核的磁相互作用引起的通过电子壳层传递的，使分子中的核在电子壳层中感应出一个磁矩，然后再作用到被侧核上，从而改变了被侧核的共振条件，使谱线分裂为多重线。这种谱线的精细结构也称为自旋自旋分裂。n驰豫时间：核自旋系统由于受到外界作用离开平衡状态后，能够自动地向平衡状态恢复，即从高能级恢复到基态的过程称为弛豫过程。弛豫现象是由于物质相互作用而发生的，弛豫时间是描述这种相互作用的参数。T1称为纵向弛豫时间，描述核磁化强度M的纵向分

30、量的恢复过程及自旋与晶格（周围介质）的相互作用，因此也称为自旋晶格弛豫时间 ，T2为横向弛豫时间，描述M的横行分量恢复的过程及自旋与自旋相互作用，因此也称为自旋自旋弛豫时间。 核磁共振波谱仪原理 n两个磁铁产生均匀、稳定的静磁场Ho，两磁极间放样品管，并有一机械旋转装置，可使样品管在两极间旋转。样品管外面是射频振荡线圈，它被安装在与外磁场Ho垂直的方向，可发射固定频率的无线电波如：60、80、90、100、200MHz等。该磁场的有效部分是一个强度为H1绕着H0旋转的磁场，当射频频率等于核的进动频率（=H0）时，发生共振。把得到的信号送到射频接收器，经射频放大器放大，通过相位调节，得到所需要的

31、纯吸收型或色散型信号，并由记录器给出谱图。 射频发生器射频接收器电磁铁N电磁铁S线圈记录仪扫描发生器生物NMRn生物NMR研究需要采用超导高分辨率的谱仪，场强尽可能高。一般采用500MHz以上的谱仪。谱仪射频发生器和去偶器要求频率范围宽，射频脉冲的频率、相位和功率的调节要精细。不同射频通道产生的脉冲在相位上要相干。功率放大器要求功率大而稳定，并可程控地衰减和传输。n生物NMR实际操作要求：样品的温度控制、样品的锁场、探头调谐、匀场调节、脉冲锁定等。n在进行实验数据参数设定时，主要考虑以下几点：中心频率设定、谱宽设定、数据点设定、接收器增益设定、水峰抑制等。影响谱峰质量的环境因素：地基震动造成磁

32、场调制、室温的变化、磁场漂移等这些因素都将使噪音增大。n 近代生物NMR研究一般采用二维NMR实验技术，对于更复杂的生物大分子，还可采用更先进的三维和四维异核NMR实验技术，它需要同位素N15 和C13标记的样品 。920 MHz NMR Magnet for Protein Structure Analysis生物NMR常用实验技术n同核相关谱（COSY）用来鉴定具有偶合关系的质子对。其形态为矩形图谱中间分布着一些同心圆，实际上是一些吸收峰的等高线截面图，称为交叉或相关峰，表示相应质子间存在着偶合关系。n双量子滤波相关谱（DQF-COSY）一般采用所谓时间相位比例增量法(TPPI)记录谱图，

33、即所谓的相敏COSY谱。其每一个交叉峰都由若干个正负相间的信号组成，其所构成的精细结构包含有质子间复杂的偶合关系和偶合常数等进一步的信息。 n全相关谱(TOCSY) 又称 HOHAHA谱，在它的脉冲序列中包含有自旋锁定的步骤，能将一个自旋体系的全部自旋相关联。nNOE相关谱（NOESY）用于鉴定质子在空间的相互接近。空间相互接近的质子之间，会产生交叉驰豫的现象，即NOE效应。nROESY谱 是在一种旋转坐标下测定的NOESY谱 。 1 Dimensional NMR Spectroscopy 1D NMR spectrum of a proteinTwo Dimensional NMR Spe

34、ctroscopy Do something with the nulcei (preparation), let them precess freely (evolution), do something else (mixing), and detect the result (detection, of course). Two Dimensional NMR SpectroscopyA diagonal of signals (A and B) divides the spectrum in two equal halves. Symmetrical to this diagonal,

35、 there are more signals (X), called cross signals. the cross signals contain the really important information of 2D NMR In the TOCSY experiment, magnetization is dispersed over a complete spinsystem of an amino acid by successive scalar coupling. NMR测定蛋白质三维结构的基本过程 Protein solution structure determin

36、ation using multi-dimensional NMR experimentsOutline of the structural analysis of proteins using NMR. Protein sample is placed inside a super-conducting magnet (1), and raw data (2) is obtained. The raw data is processed by a mathematical operation called Fourier transformation, which gives a spect

37、rum (3). Structural information (4) is extracted from further analysis of the spectrum. The final protein structure is deduced from the structural information. 蛋白质三维结构NMR波谱分析protein structure determinationAn example of the complex pattern obtained from NMR spectroscopy (left), which correlates the n

38、itrogen atoms (15N; vertical axis) of amide groups with the hydrogen atoms (1H; horizontal axis) in a protein. A complex series of measurements that correlate other nuclei (carbonhydrogen, hydrogenhydrogen), calculations and deductions allows the structure of the protein to be derived (right). NMR在生

39、物应用中的优越性 被测的生物样品不被破坏； 能测定与生物状态接近的 溶液中生物高分子的结构与浓度； 研究生物样品的动力学过程及其 相应的能量变化规律； 能获得多种参数，为分析生物分 子结构提供多种信息； 能研究生物高分子构像的动力学； 可测定多种原子核，如，H1、 C13、P31、N14等。 AVANCE ICE 600NMR所提供的信息n可以测定蛋白质分子 中的螺旋含量；n可以记录蛋白质分子 中螺旋与无规则卷曲 之间的转化过程；n可以观察小分子或金属 离子与蛋白质特定区域的结合；n可以测定蛋白质特定区域的构像；n可以测定电子传递蛋白分子中的顺磁性活性部位。NMR研究蛋白质结构实验方法 n由N

40、MR数据决定蛋白质结构是一个十分漫长而复杂的过程，但大体可分为五个步骤：n研究样品的选择与制备： 1. 样品选择：分子量、样品量、溶解度、样品纯度、稳定性 2. 核磁样品管：选择、清洗、干燥、样品体积等。 3. 样品制作：浓缩方法 、脱盐和缓冲剂交换 、水-重水的交 换 、过滤方法 、样品的脱气 等。 4. 样品参数：pH值、离子强度、缓冲液种类、溶剂浓度、表面活性剂的增溶作用、样品温度、化学位移参考物。 5. 防止样品污染：顺磁性物质（金属）、微生物污染nNMR数据的采集与数据处理：中心频率、谱宽、数据点、接收器增益设定和水峰抑制。n质子自旋系统的识别与信号归属；n决定结构约束因子和分析规则

41、二级结构；n计算出符合约束因子的三维结构和进行结构精修；生物大分子溶液构象的确定 蛋白质样品的获得 n蛋白质样品通常由在原核系统克隆、表达获得，也可在真核系统获得。n对一些小肽，则可用化学合成的方法。n对需由表达而得到的样品，必须构建过表达系统以获取大量的样品，来满足核磁共振实验的需要。通常来讲，最好能由1L培养液得到10mg以上的纯蛋白质，而且要尽可能避免生成包含体，一保证构象的纯度。n对分子量大于8000的蛋白质还需要进行15N或15N/13C标记；分子量大于20000的蛋白质，在条件允许的情况下，还可在15N/13C标记的同时进行2H标记，以提高谱图质量。n对需要全标记的蛋白质，通常将细

42、菌放在M9培养基里生长，以15NH4Cl为氮源，13C6-葡萄糖为碳源。对那些同时还需要2H标记的蛋白质，则还须将培养基里H2O用D2O来代替。若须选取某一种氨基酸残基进行标记，则通常采用营养缺陷型的菌株。另外还有其他许多种可以采用的标记方法，以满足不同实验目的的需要。最近，Nagayama等人将一个很大的蛋白分段克隆表达，并对其中一段进行了15N/13C标记，然后将所得的蛋白质片段在一种酶的作用下连接起来，得到了一个局部片段标记的蛋白质，大大简化了谱图。这种方法将会在分子量较大的蛋白质结构研究中发挥重要作用。 生物大分子溶液构象的确定 核酸样品的获得n核酸样品通常由化学合成或体外转录方法得到

43、。DNA通常由化学合成获得，而RNA则既可以由化学合成获得，又可以通过体外转录方法得到，而且后一种方法更常用。n核酸的稳定同位素标记要比蛋白质的标记复杂。利用体外转录方法获得标记的RNA样品所需过程较复杂。由于所需标记的NTP量较大，通常都由自己制备。将普通的E.coli菌株在M9或M9-甘油培养基里生长，用15NH4Cl或(15NH4)2SO4替代相应的普通盐，或同时用13C6-葡萄糖或13C3-甘油替代普通的葡萄糖/甘油。也可用嗜甲醇菌在以13C-甲醇为碳源的培养基里生长。分离提取收获的细菌中的rRNA或DNA，经水解得到NMP或dNMP，再经磷酸化得到NTP或dNTP，以此作为原料，进行

44、下一步的合成或转录工作。在利用T 7 RNA聚合酶的体外转录方法已被广泛用于RNA的结构研究数年之后，才有关于利用DNA聚合酶获得标记的DNA样品的报道。核磁共振样品的制备 n灵敏度低是核磁共振的生物应用所碰到的最大问题。核磁共振信号的强度与处于谱仪中“灵敏体积”内的样品的量成正比。通常所用的样品管为5mm。最佳样品体积大约为400l。为了提高信噪比，信号通常会被累加许多次。信噪比的增加正比于累加次数的平方根。例如，要得到同样的信噪比，一个0.5mM的样品所需累加时间为一个1.0mM样品的4倍。对结构研究而言，大分子的浓度至少需要0.5mM以上，对多维实验，则需要1-3mM。随着磁场强度的提高

45、以及低温探头的出现，核磁共振的灵敏度正在逐步提高。在样品量足够的情况下，溶解度则成了限制因素。n样品还必须能在核磁共振实验过程中保持稳定。要防止空气氧化，微生物污染，水解等现象的发生，以延长样品在样品管中的寿命。对那些本来就不稳定的样品，则很难得到高分辨谱图。在长时间核磁共振实验的前后，最好对样品用电泳或测酶活性等方法进行检查，以确保样品仍保持正常状态。其实，最简单又好的方法，就是做一张1H谱，如果前后的谱图是一致的，则证明样品没有变化。分子量的增大对核磁共振谱有两方面的影响：n(a) 谱的复杂程度会增加。较大的分子会产生较多的谱峰。当在一个给定的频率间隔内谱峰数目增加时，谱峰的重叠也随之增加

46、，谱图解析也越困难。n(b) 每条谱峰的线宽也会增加。分子越大，其旋转相关时间（c，分子旋转通过1弧度所需时间）也越大。而线宽是与c成正比的。线宽越大，谱线强度就减小，谱峰重叠也增加。n可以用稳定同位素标记(15N, 13C, 2H) 和谱编辑技术来减小谱的复杂程度。多维核磁共振技术可以减小谱峰重叠。目前核磁共振方法能够解析的蛋白质的分子量约为30，000左右，核酸约为40个碱基左右。生物大分子的核磁共振实验n通常只检测样品的一维1H谱，其作用主要限于对样品进行初步检查，或针对谱图中可识别的，与其他谱峰不重叠的一些峰（如色氨酸和组氨酸的峰），进行温度、pH值、重水交换等因素变化的影响实验。n二

47、维核磁共振实验包括同核和异核实验。同核实验主要有1H-1H COSY，TOCSY，E.COSY, NOESY，ROESY，relay-NOESY等实验，主要用于自旋体系（残基内部）的谱峰确认，耦合常数的测定，顺序识别，以及由NOE交叉峰的强度得出质子间距离约束条件。这也是非标记样品所能进行的主要实验。n异核二维实验包括1H-15N HSQC，HMQC，1H-13C HSQC， HMQC，用于标记样品中质子与其他核之间的关联和谱峰识别。在核酸结构研究中，1H-31P HETTOCSY也被广泛采用来作核糖谱峰的识别和序列的顺序识别。n对于较大的蛋白质分子，还需要利用15N或15N/13C标记的样品

48、进行三维实验。这些实验又可大致氛围两类，即利用异核编辑技术的三维实验和三共振实验。前者是利用不同残基中15N和13C核的化学位移的差异，将二维COSY，TOCSY，NOESY谱中重叠在一个平面内的谱峰按照不同的15N和13C化学位移，分别放入不同的平面内，这样就大大地简化了谱图。这些实验在确定残基的自旋体系和NOE相关峰指定时起着重要作用。三共振实验在标记样品的实验中起着非常重要的作用，这类实验完全利用1H，13C，15N核之间的化学键连接来得到核磁共振相关信号。与只利用1H-1H耦合常数的实验相比，由于大多数异核之间的耦合常数（1J）都较大，使得它们之间的信号传递较有效；利用异核化学位移使得

49、谱图被大大地简化了；谱图的顺序指认比依赖NOE信号的方法更可靠。所有的三共振实验都是根据信号传递路径来取名的。结构计算 约束条件n包括由NOE得到的距离约束和由耦合常数得到的二面角约束。计算出的结构的好坏由方均根偏差（RMSD）来衡量。如果所计算的大部分结构都能够收敛，并且满足所有的核磁共振约束条件，同时每一对结构之间的RMSD小于0.2nm，则表明计得到的结构与实际结构是接近的。RMSD在0.15-0.2nm之间的NMR结构通常缺乏细部结构。而分辨率较高的结构其主干原子的RMSD通常在0.08nm左右，主干原子及一部分侧链重原子的RMSD在0.1nm左右，而包括所有原子的RMSD在0.15n

50、m左右。n从约束条件方面来讲，每个残基只需5个约束条件就可以得到低分辨的结构；而要得到分辨率非常高的结构，如果只靠1H数据，每个残基需要大约15个约束条件。在这种情况下，对于有很好的二级结构的区域，主干原子与平均结构的RMSD只有大约0.05nm。如果采用15N或13C标记的样品，则可以使更多的1H-1H NOE可以被确认，使每个残基的约束条件增加到20至25之间，得到的结构的精度也大大提高（主干原子的RMSD在0.03-0.05nm之间）。这样，就必须对数百甚至上千个NOE交叉峰进行准确无误的指认。对于前手性基团（特别是CbH2,以及Val和Leu残基中的(CH3)2CH基团）的空间特异性指认，是得到高精度结构的关键。生物大分子在溶液中的运动 n用核磁共振研究生物大分子的优点在于用它不但可以得到分子的结构，还可以研究分子的运动，而正是这种分子运动在生物大分子实现其功能的过程中起着重要的作用。n蛋白质不是一个刚性、孤立的分子，要了解其功